مجموعة ELISA للحمض النووي الريبي المزدوج (dsRNA).

هذه المجموعة عبارة عن مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) مقترنة بنظام البيوتين-ستربتافيدين، للقياس الكمي للـ dsRNA بطول يزيد عن 60 زوجًا أساسيًا (bp)، بغض النظر عن التسلسل.لقد تم طلاء اللوحة مسبقًا بأجسام مضادة للـ dsRNA.تتم إضافة الرنا المزدوج الجديلة الموجود في العينة ويرتبط بالأجسام المضادة المطلية على الآبار.وبعد ذلك تتم إضافة الجسم المضاد المضاد للـ dsRNA المحتوي على بيوتينيل ويرتبط بالـ dsRNA في العينة.بعد الغسيل، تتم إضافة HRP-Streptavidin ويرتبط بالجسم المضاد لـ Biotinylated anti-dsRNA.بعد الحضانة، يتم غسل HRP-Streptavidin غير المنضم.ثم تتم إضافة محلول الركيزة TMB وتحفيزه بواسطة HRP لإنتاج منتج ذو لون أزرق يتحول إلى اللون الأصفر بعد إضافة محلول التوقف الحمضي.تتناسب كثافة اللون الأصفر مع الكمية المستهدفة من الرنا المزدوج الجديلة التي تم التقاطها في اللوحة.يتم قياس الامتصاص عند 450 نانومتر.

طلب

هذه المجموعة مخصصة للقياس الكمي للdsRNA المتبقي.

مكونات الطقم

التخزين والاستقرار

1. بالنسبة للمجموعة غير المستخدمة: يمكن تخزين المجموعة بأكملها في درجة حرارة تتراوح من 2 إلى 8 درجات مئوية خلال مدة الصلاحية.يجب تجنب الضوء القوي من أجل استقرار التخزين.

2. بالنسبة للمجموعة المستخدمة: بمجرد فتح اللوحة الدقيقة، يرجى تغطية الآبار غير المستخدمة باستخدام لوحة السداد والعودة إلى كيس الرقائق الذي يحتوي على حزمة المجففة، وإغلاق كيس الرقائق بسحاب والعودة إلى 2 ~ 8 درجة مئوية في أقرب وقت ممكن بعد الاستخدام.يجب إعادة الكواشف الأخرى إلى 2 ~ 8 درجة مئوية في أقرب وقت ممكن بعد الاستخدام.

المواد المطلوبة ولكن غير متوفرة

1. قارئ صفيحة ميكروية مع مرشح 450 ± 10 نانومتر (من الأفضل أن يتمكن من الكشف عند الطول الموجي 450 و650 نانومتر).

2. شاكر صفيحة ميكروسكوبية.

3. أطراف خالية من RNase وأنابيب الطرد المركزي.

مخطط انسيابي للعملية

قبل ان تبدأ

1. قم بإحضار جميع مكونات وعينات المجموعة إلى درجة حرارة الغرفة (18-25 درجة مئوية) قبل الاستخدام.إذا لم يتم استخدام المجموعة مرة واحدة، فيرجى إخراج الشرائط والكواشف الخاصة بالتجربة الحالية فقط، وترك الشرائط والكواشف المتبقية في الحالة المطلوبة.

2. محلول الغسيل: قم بتخفيف 40 مل من 20 × محلول غسيل مركز مع 760 مل من الماء منزوع الأيونات أو الماء المقطر لتحضير 800 مل من 1 × محلول غسيل.

3. قياسي: قم بتدوير محلول المخزون أو طرده لفترة وجيزة قبل الاستخدام.تركيز المعايير الأربعة المقدمة هو 5ng/μL.بالنسبة لمعايير UTP وpUTP dsRNA، يرجى تخفيف محلول المخزون إلى 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL مع المخزن المؤقت STE لرسم المنحنى القياسي.بالنسبة لمعايير N1-Me-pUTP dsRNA، يرجى تخفيف محلول المخزون إلى 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312، 0pg/μL مع المخزن المؤقت STE لرسم المنحنى القياسي.بالنسبة لمعيار 5-OMe-UTP dsRNA، يرجى تخفيف محلول المخزون إلى 4,2,1,0.5، 0.25,0.125,0.0625، 0pg/μL مع المخزن المؤقت STE لرسم المنحنى القياسي.نوصي بتخفيف المعايير على النحو التالي:

4. الأجسام المضادة للكشف عن Biotinylated وحل العمل HRP-streptavidin: تدور لفترة وجيزة أو الطرد المركزي الحل المخزون قبل الاستخدام.تمييعهم إلى تركيز العمل مع المخزن المؤقت للتخفيف.

5. الحالة الفرعية TMB: قم بسحب الجرعة المطلوبة من المحلول باستخدام أطراف معقمة ولا تقم بتفريغ المحلول المتبقي في القارورة مرة أخرى.الحالة الفرعية TMB حساسة للضوء، لا تعرض الركيزة TMB للضوء لفترة طويلة.

باستخدام البروتوكول

1. تحديد عدد الشرائط المطلوبة للمقايسة.أدخل الشرائط في الإطارات للاستخدام.ينبغي إعادة تعبئة شرائح اللوحة المتبقية غير المستخدمة في هذا الاختبار في الكيس بالمجففة.أغلق الكيس بإحكام للتخزين المبرد.

2. أضف 100 ميكرولتر من كل من التخفيفات القياسية والفارغة والعينات إلى الآبار المناسبة.تغطية مع السداده لوحة.احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الهز عند 500 دورة في الدقيقة.ينبغي تخفيف العينات باستخدام محلول STE للتركيز المناسب لإجراء فحص دقيق.

3. خطوة الغسل: اسحب المحلول واغسله باستخدام محلول غسيل سعة 250 ميكرولتر لكل بئر واتركه لمدة 30 ثانية.تخلص من عازلة الغسيل تمامًا عن طريق وضع اللوحة على ورق ماص.يغسل تماما 4 مرات.

4. أضف 100 ميكرولتر من محلول عمل الأجسام المضادة للكشف عن البيوتينيل في كل بئر.تغطية مع السداده لوحة.احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الهز عند 500 دورة في الدقيقة.

5. كرر خطوة الغسيل.

6. أضف 100 ميكرولتر من محلول HRP-streptavidin العامل إلى كل بئر.تغطية مع السداده لوحة.احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الهز عند 500 دورة في الدقيقة.

7. كرر خطوة الغسيل مرة أخرى.

8. أضف 100 ميكرولتر من محلول الركيزة TMB إلى كل بئر.تغطية مع السداده لوحة.احتضان لمدة 30 دقيقة على RT حماية من الضوء.سوف يتحول السائل إلى اللون الأزرق بإضافة محلول الركيزة.

9. أضف 50 ميكرولتر من محلول الإيقاف إلى كل بئر.سوف يتحول السائل إلى اللون الأصفر بإضافة محلول التوقف.ثم قم بتشغيل قارئ الصفيحة الدقيقة وإجراء القياس عند 450 نانومتر على الفور.

حساب النتائج

1. قم بمتوسط ​​القراءات المكررة لكل معيار وتحكم وعينات وطرح متوسط ​​الكثافة الضوئية القياسية الصفرية.بناء منحنى قياسي مع الامتصاص على المحور الرأسي (Y) وتركيز الرنا المزدوج الجديلة على المحور الأفقي (X).

2. يوصى بإجراء الحساب باستخدام برنامج تركيب المنحنيات القائم على الكمبيوتر مثل Curve Expert 1.3 أو ELISA Calc في نموذج ملائم غير خطي ذو 5 أو 4 معلمات.

أداء

1. الحساسية:

الحد الأدنى للكشف: ≥ 0.001pg/μL (لـ UTP-، pUTP-، N1-Me-pUTP-dsRNA)، ≥ 0.01pg/μL (لـ 5-OMe-UTP-dsRNA).

الحد الأدنى للكمية: 0.0156 بيكوغرام / ميكرولتر (لـ UTP-، pUTP-dsRNA)، 0.0312 بيكوغرام / ميكرولتر (لـ N1-Me-pUTP-dsRNA)، 0.0625 بيكوغرام / ميكرولتر (لـ 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. الدقة: السيرة الذاتية للمقايسة البينية ≥10%، السيرة الذاتية للمقايسة البينية ≥10%

3. الاسترداد: 80%~120%

4. الخطي: 0.0156-0.5pg/μL (forUTP-، pUTP-dsRNA) 0.0312-1pg/μL (forN1-Me-pUTP dsRNA)، 0.0625-1pg/μL (لـ 5-OMe-UTP-dsRNA).

اعتبارات

1. درجة حرارة تفاعل TMB ووقته أمر بالغ الأهمية، يرجى التحكم فيها وفقًا للتعليمات بدقة.

2. من أجل تحقيق استنساخ فحص جيد وحساسية، الغسيل السليم للوحات لإزالة الكواشف الزائدة غير المتفاعلة أمر ضروري.

3. يجب خلط جميع الكواشف جيدًا قبل الاستخدام وتجنب التعثر أثناء إضافة العينة أو الكواشف.

4. إذا تكونت بلورات في محلول الغسيل المركز (20x)، قم بتسخينها إلى 37 درجة مئوية واخلطها بلطف حتى تذوب البلورات تمامًا.

5. تجنب فحص العينات التي تحتوي على أزيد الصوديوم (NaN3)، لأنها يمكن أن تدمر نشاط HRP مما يؤدي إلى التقليل من كمية الرنا المزدوج الجديلة.

6. تجنب تلوث ريبونوكلياز أثناء الفحص.

7. يمكن أيضًا إجراء المعيار/العينة والجسم المضاد للكشف وSA-HRP عند RT دون اهتزاز، ولكن هذا قد يتسبب في انخفاض حساسية الكشف بمقدار مرة واحدة.في هذه الحالة، نوصي بتخفيف معايير UTP وpUTP dsRNA من 2pg/μL، ويجب تخفيف معايير N1-Me-pUTP dsRNA من 4pg/μL ويجب تخفيف معيار 5-OMe-UTP dsRNA من 8pg/μL.وبالإضافة إلى ذلك، احتضان حل العمل HRP-streptavidin لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.لا تستخدم شاكر القارورة، لأن شاكر القارورة قد يؤدي إلى نتيجة غير دقيقة.

نتيجة نموذجية

1. بيانات المنحنى القياسي

2. حساب المنحنى القياسي

3. نطاق الكشف عن الخطوط الملاحية المنتظمة: 0.0312-1pg/ميكروليتر