بروتيناز K (مسحوق مجفف بالتجميد)
رقم القط: HC4500A
بروتيناز K هو بروتياز سيرين مستقر ذو خصوصية واسعة للركيزة.إنه يتحلل العديد من البروتينات في حالته الأصلية حتى في وجود المنظفات.تشير الأدلة المستمدة من دراسات التركيب البلوري والجزيئي إلى أن الإنزيم ينتمي إلى عائلة سبتيليسين مع ثالوث محفز نشط في الموقع (Asp39-له69- سر224).الموقع السائد للانقسام هو الرابطة الببتيدية المجاورة لمجموعة الكربوكسيل من الأحماض الأمينية الأليفاتية والعطرية مع مجموعات ألفا أمينية محجوبة.ويستخدم عادة لنطاقه الواسعالنوعية.
شروط التخزين
تخزين قصير المدى 2-8 درجة مئوية، -25 ~ -15 درجة مئوية تخزين طويل المدى.حالة المسحوق الجاف -25~-15°C صالحة لمدة 3 سنوات؛يجب أن يذوب مسحوق الإنزيم في الحجم المناسب.
تخصيص
| مظهر | مسحوق مجفف بالتجميد أبيض إلى أبيض غير متبلور |
| نشاط | ≥30 وحدة / ملغ |
| الدناز | أيا الكشف |
| رناسي | أيا الكشف |
ملكيات
| رقم المفوضية الأوروبية | 3.4.21.64 (مؤتلف من ألبوم Tritirachium) |
| الوزن الجزيئي الغرامي | 29 كيلو دالتون (SDS-PAGE) |
| نقطة تساوي الكهربية | 7.81 |
| الرقم الهيدروجيني الأمثل | 7.0-12.0 الشكل 1 |
| درجة الحرارة المثلى | 65 درجة مئوية الشكل 2 |
| استقرار الرقم الهيدروجيني | الرقم الهيدروجيني 4.5-12.5 (25 درجة مئوية، 16 ساعة) الشكل 3 |
| الاستقرار الحراري | أقل من 50 درجة مئوية (درجة الحموضة 8.0، 30 دقيقة) الشكل 4 |
| المنشطات | الحزب الديمقراطي الصربي، واليوريا |
| مثبطات | ثنائي إيزوبروبيل فلوروفوسفات؛فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل |
التطبيقات
1. طقم التشخيص الوراثي
2. مجموعات استخراج الحمض النووي الريبي (RNA) والحمض النووي (DNA).
3. استخلاص المكونات غير البروتينية من الأنسجة وتحلل شوائب البروتين مثل لقاحات الحمض النووي وتحضير الهيبارين
4. تحضير الحمض النووي الكروموسومي عن طريق الفصل الكهربائي النبضي
5. لطخة غربية
6. كواشف الألبومين الإنزيمية الغليكوزيلية في التشخيص المختبري
احتياطات
قم بارتداء القفازات والنظارات الواقية عند الاستخدام أو الوزن، وحافظ على التهوية الجيدة بعد الاستخدام.قد يسبب هذا المنتج رد فعل تحسسي للجلد وتهيجًا خطيرًا للعين.وفي حالة استنشاقه قد يسبب أعراض الحساسية أو الربو أو ضيق التنفس.قد يسبب تهيج الجهاز التنفسي.
فحص
تعريف الوحدة
يتم تعريف وحدة واحدة (U) على أنها كمية الإنزيم المطلوبة لتحلل الكازين لإنتاج 1 ميكرومول من التيروزين في الدقيقة في ظل الظروف التالية.
تحضير الكواشف
الكاشف الأول: تم إذابة 1 جم من كازين الحليب في 50 مل من محلول فوسفات الصوديوم 0.1 م (درجة الحموضة 8.0)، وحضنت في ماء بدرجة حرارة 65-70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، وتم التقليب والذوبان، ثم تبريدها بالماء، وضبطها بواسطة هيدروكسيد الصوديوم إلى درجة الحموضة 8.0، وحجم ثابت. 100 مل.
الكاشف الثاني: 0.1 م حمض ثلاثي كلورو أسيتيك، 0.2 م خلات الصوديوم، 0.3 م حمض أسيتيك.
الكاشف الثالث: 0.4M نا2CO3حل.
الكاشف الرابع: كاشف الفورينت المخفف بالماء النقي لمدة 5 مرات.
الكاشف الخامس: مخفف الإنزيم: 0.1 م محلول فوسفات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 8.0).
الكاشف السادس: محلول التيروزين: 0، 0.005، 0.025، 0.05، 0.075، 0.1، 0.25 أومول/مل تيروزين مذاب مع 0.2M HCL.
إجراء
1. يتم تسخين 0.5 مل من الكاشف I مسبقًا إلى 37 درجة مئوية، وإضافة 0.5 مل من محلول الإنزيم، وتخلط جيدًا، وتحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
2. أضف 1 مل من الكاشف II لإيقاف التفاعل، واخلط جيدًا، واستمر في الحضانة لمدة 30 دقيقة.
3. حل رد الفعل بالطرد المركزي.
4. خذ 0.5 مل من المادة الطافية، وأضف 2.5 مل من الكاشف III، و0.5 مل من الكاشف IV، واخلط جيدًا واحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
5. التطوير التنظيمي660تم تحديده على أنه OD1;مجموعة التحكم الفارغة: يستخدم الكاشف V 0.5 مل ليحل محل محلول الإنزيم لتحديد OD660كما التطوير التنظيمي2، ΔOD=OD1-OD2.
6. منحنى L-tyrosine القياسي: 0.5 مل محلول تيروزين بتركيز مختلف، 2.5 مل كاشف III، 0.5 مل كاشف IV في أنبوب طرد مركزي 5 مل، احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، كشف عن OD660لتركيزات مختلفة من L-tyrosine، ثم الحصول على المنحنى القياسي Y=kX+b، حيث Y هو تركيز L-tyrosine، X هو OD600.
عملية حسابية
2: الحجم الإجمالي لمحلول التفاعل (مل)
0.5: حجم محلول الإنزيم (مل)
0.5: حجم سائل التفاعل المستخدم في تحديد اللونية (مل)
10: وقت رد الفعل (دقيقة)
Df: التخفيف المتعدد
C: تركيز الإنزيم (ملجم/مل)
مراجع
1. ويجر يو وهيلز إتش. فيبس ليت.(1972);23:77.
2. ويجر يو وهيلز هـ. الكيمياء الحيوية.بيوفيس.الدقة.مشترك.(1971);44:513.
3. هيلز، ه.وآخرون.،يورو.جي. الكيمياء الحيوية.(1975);56:103–108.
4. سامبروك جet آل، الاستنساخ الجزيئي: دليل المختبر، الطبعة الثانية، مطبعة كولد سبرينج هاربور، كولد سبرينج هاربور (1989).
الشكل 2: درجة الحرارة المثلى
رد الفعل في 20 ملم K- الفوسفات العازلة درجة الحموضة 8.0.تركيز الانزيم: 1 ملغم/مل
الشكل 3 الرقم الهيدروجيني استقرار
25 درجة مئوية، معالجة لمدة 16 ساعة بمحلول منظم 50 مم: درجة الحموضة 4.5-5.5، أسيتات؛الرقم الهيدروجيني 6.0-8.0، فوسفات الصوديوم؛الرقم الهيدروجيني 8.0-9.0، تريس-حمض الهيدروكلوريك.درجة الحموضة 9.0-12.5، جليكاين هيدروكسيد الصوديوم.تركيز الانزيم: 1 ملغم/مل
الشكل 4: حراري استقرار
معالجة لمدة 30 دقيقة باستخدام 50 ملي مولار من محلول Tris-HCL، درجة الحموضة 8.0.تركيز الانزيم: 1 ملغم/مل
الشكل 5: التخزين استقرارty at 25 درجة مئوية
