مرنا Cap2'-O- ميثيل ترانسفيراز
تم اشتقاق mRNA Cap 2´-O-methyltransferase من سلالة E. coli المؤتلفة التي تحمل جين لقاح mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase.يضيف هذا الإنزيم مجموعة ميثيل عند الموضع 2´-O للنيوكليوتيدات الأولى المتاخمة لبنية الغطاء عند الطرف 5´ من الحمض النووي الريبي (RNA). يستخدم الإنزيم S-adenosylmethionine (SAM) كمانح ميثيل لحمض RNA المغطى بالميثيل (غطاء -0) مما أدى إلى هيكل سقف 1.
يمكن أن يزيد هيكل Cap1 من كفاءة الترجمة، مما يحسن التعبير عن mRNA في تجارب ترنسفكأيشن والحقن المجهري. يتطلب هذا الإنزيم على وجه التحديد RNA مع غطاء m7GpppN كركيزة.لا يمكنها استخدام الحمض النووي الريبي (RNA) مع pN أو ppN أو pppN أو GpppN عند النهاية 5´.يمكن تحضير الحمض النووي الريبي المغطى عن طريق النسخ في المختبر باستخدام تناظرية الغطاء أو من خلال التغطية الأنزيمية باستخدام إنزيم Vaccinia Capping.
عناصر
مرنا كاب 2´-O-ميثيل ترانسفيراز (50U/ميكروليتر)
10 × غطاء عازل للتفاعل
تخزين
-25 ~- 15 درجة مئوية للتخزين (تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة)
المخزن المؤقت للتخزين
20 ملي مولار تريس-حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.0،25 درجة مئوية)، 100 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1 ملي مولار DTT، 0.1 ملي مولار EDTA، 0.1% تريتون X- 100، 50% جلسرين.
تعريف الوحدة
يتم تعريف الوحدة الواحدة على أنها كمية الإنزيم المطلوبة لميثيل 10 بمول من 80 nt من نسخة RNA المغطاة في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.
فحوصات مراقبة الجودة
نوكلياز خارجي:50U من mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase مع 1μg LA-Hind III لهضم الحمض النووي عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة لا ينتج عنه أي تدهور كما هو محدد بواسطة الفصل الكهربائي لهلام الاغاروز.
نوكلياز داخلي: 50 وحدة من mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase مع 1 ميكروجرام αDNA عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة لا ينتج عنها أي تحلل على النحو الذي يحدده الفصل الكهربائي لهلام الاغاروز.
نيكاسي: 50U من mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase مع 1μg pBR322 عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة لا ينتج عنه أي تدهور كما هو محدد بواسطة الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز.
رناسي: 50U من mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase مع 1.6μg MS2 RNA لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية لا ينتج عنها أي تحلل على النحو الذي يحدده الفصل الكهربائي لهلام الاغاروز.
E. القولونية الحمض النووي: يتم فحص 50U من mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase لوجودE. القولونية الحمض النووي الجينومي باستخدام TaqMan qPCR مع الاشعال الخاصة بـE. القولونية موضع الرنا الريباسي 16S.الE. القولونية تلوث الحمض النووي الجينومي = 1E. القولونية الجينوم.
بكتيرية السموم الداخلية: اختبار LAL، وفقًا لدستور الأدوية الصيني إصدار 2020، طريقة اختبار حدود الهلام، القاعدة العامة (1143).يجب أن يكون محتوى السموم الداخلية البكتيرية = 10 EU/mg.
نظام التفاعل وشروطه
الجمع بين كمية مناسبة من الحمض النووي الريبي المغطى وH2O خالية من RNase في أنبوب microfuge سعة 1.5 مل إلى الحجم النهائي قدره 16.0 ميكرولتر.
2. قم بتسخينه عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق يليه حمام جليدي لمدة 5 دقائق.
3. أضف المكونات التالية بالترتيب المحدد (لمثيلة الحمض النووي الريبي المغطى
اقل من 10
عنصر | مقدار |
الحمض النووي الريبي المغطى بالتشويه والتشويه | 16 ميكرولتر |
10X عازلة رد الفعل السد * | 2 ميكرولتر |
سام (4 ملم) | 1 ميكرولتر |
مرنا كاب 2´-O-ميثيل ترانسفيراز (50 وحدة/ميكروليتر) | 1 ميكرولتر |
ddH2O | إلى 20 ميكرولتر |
*10 × المخزن المؤقت للتفاعل: 500 ملي مولار تريس-حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.0، 25 درجة مئوية)، 50 ملي مول كلوريد الكربون، 10 ملي مولار MgCl2، 10 ملي مولار DTT.
4. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة (يوصى بساعتين من الحضانة للجزء المستهدف أقل من 200 nt).
التطبيقات
لتحسين التعبير مرنا أثناء تجارب الحقن المجهري وترنسفكأيشن.
ملاحظات حول الاستخدام
1. قبل التفاعل، يجب تنقية الحمض النووي الريبي (RNA) وإذابته في ماء خالي من النيوكلياز، ويجب ألا تحتوي جميع المحاليل على أي EDTA أو أيونات.
2. يوصى بتسخين عينة الحمض النووي الريبي (RNA) عند درجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق قبل التفاعل لإزالة البنية الثانوية في الطرف 5 من النص.يمكن تمديده إلى 10 دقائق للبنية الطرفية المعقدة ذات 5 ′.