PNGase F
يعتبر Peptide-N-Glycosidase F (PNGase F) الطريقة الأنزيمية الأكثر فعالية لإزالة جميع السكريات قليلة السكاريد المرتبطة بـ N تقريبًا من البروتينات السكرية.PNGase F هو إنزيم وسط، الذي ينشق بين معظم بقايا GlcNAc والأسباراجين من السكريات عالية المانوز والهجينة والمعقدة من البروتينات السكرية المرتبطة بـ N.
طلب
هذا الإنزيم مفيد لإزالة بقايا الكربوهيدرات من البروتينات.
التحضير والمواصفات
| مظهر | سائل عديم اللون |
| نقاء البروتين | ≥95% (من SDS-PAGE) |
| نشاط | ≥500,000 وحدة / مل |
| إكسوغليكوزيداز | لا يمكن اكتشاف أي نشاط (ND) |
| إندوغليكوزيداز F1 | ND |
| إندوغليكوزيداز F2 | ND |
| إندوغليكوزيداز F3 | ND |
| إندوغليكوزيداز H | ND |
| البروتياز | ND |
ملكيات
| رقم المفوضية الأوروبية | 3.5.1.52(مؤتلف من الكائنات الحية الدقيقة) |
| الوزن الجزيئي الغرامي | 35 كيلو دالتون (SDS-PAGE) |
| نقطة تساوي الكهربية | 8. 14 |
| الرقم الهيدروجيني الأمثل | 7.0-8.0 |
| درجة الحرارة المثلى | 65 درجة مئوية |
| خصوصية الركيزة | تشذيب الروابط الجليكوسيدية بين GlcNAc وبقايا الأسباراجين (الشكل 1). |
| مواقع التعرف | الجليكانات المرتبطة بـ N ما لم تحتوي على فوكوز α1-3 (الشكل 2). |
| المنشطات | دي تي تي |
| المانع | الحزب الديمقراطي الصربي |
| درجة حرارة التخزين | -25 ~-15 درجة مئوية |
| تعطيل الحرارة | يتم تعطيل خليط تفاعل 20 ميكرولتر يحتوي على 1 ميكرولتر من PNGase F عن طريق الحضانة عند 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. |
الشكل 1: خصوصية الركيزة لـ PNGase F
الشكل 2: التعرف على PNGase F.
عندما ترتبط بقايا GlcNAc الداخلية بفوكوز α1-3، لا يمكن لـ PNGase F أن يفصل السكريات قليلة التعدد المرتبطة بـ N من البروتينات السكرية.هذا التعديل شائع في النباتات وبعض البروتينات السكرية في الحشرات.
Cمكونات
|
| عناصر | تركيز |
| 1 | PNGase F | 50 ميكرولتر |
| 2 | 10 × عازلة تغيير طبيعة البروتين السكري | 1000 ميكرولتر |
| 3 | 10 × جليكوبوفر 2 | 1000 ميكرولتر |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 ميكرولتر |
تعريف الوحدة
يتم تعريف الوحدة الواحدة (U) على أنها كمية الإنزيم المطلوبة لإزالة > 95% من الكربوهيدرات من 10 ميكروجرام من RNase B المشوه في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل إجمالي قدره 10 ميكرولتر.
ظروف رد الفعل
1. قم بإذابة 1-20 ميكروغرام من البروتين السكري مع الماء منزوع الأيونات، وأضف 1 ميكرولتر 10×Glycoprotein Denaturing Buffer وH2O (إذا لزم الأمر) للحصول على حجم التفاعل الإجمالي 10 ميكرولتر.
2.احتضان عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، تبريده على الجليد.
3.أضف 2 ميكرولتر 10×GlycoBuffer 2، 2 ميكرولتر 10% NP-40 واخلط.
4.إضافة 1-2 ميكرولتر PNGase F وH2O (إذا لزم الأمر) لجعل حجم التفاعل الكلي 20 ميكرولتر والمزيج.
5.احتضان رد الفعل عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
6.لتحليل SDS-PAGE أو تحليل HPLC.
