إنزيم تغطية فيروس الوقس

يُشتق إنزيم تغطية فيروس Vaccinia من سلالة E. coli المؤتلفة التي تحمل جينات إنزيم تغطية Vaccinia.يتكون هذا الإنزيم الفردي من وحدتين فرعيتين (D1 وD12) وله ثلاثة أنشطة إنزيمية (RNA triphosphatase وguanylyltransferase بواسطة الوحدة الفرعية D1 وguanine methyltransferase بواسطة الوحدة الفرعية D12).يعد إنزيم تغطية فيروس Vaccinia فعالًا في تحفيز تكوين بنية الغطاء، والتي يمكن أن تربط على وجه التحديد بنية الغطاء 7-ميثيل غوانيلات (m7Gppp، Cap 0) بالنهاية 5′ من الحمض النووي الريبي (RNA).يلعب هيكل الغطاء (Cap 0) دورًا مهمًا في تثبيت mRNA ونقله وترجمته في حقيقيات النوى.إن تغطية الحمض النووي الريبي (RNA) عن طريق التفاعل الأنزيمي هي طريقة فعالة وبسيطة يمكنها تحسين استقرار وترجمة الحمض النووي الريبي (RNA) بشكل كبير في النسخ المختبري، والترنسفكأيشن، والحقن المجهري.

عناصر

إنزيم تغطية فيروس الوقس (10 وحدة/ميكروليتر)

10×غطاء عازل

شروط التخزين

-25～- 15 درجة مئوية للتخزين (تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة)

المخزن المؤقت للتخزين

20 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.0)، 100 ملي كلوريد الصوديوم،

1 ملم DTT، 0.1 ملم EDTA، 0.1% تريتون X-100، 50% جلسرين.

تعريف الوحدة

يتم تعريف وحدة واحدة من إنزيم تغطية فيروس Vaccinia على أنها كمية الإنزيم المطلوبة لدمج 10pmol من GTP في نسخة 80nt في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.

رقابة جودة

نوكلياز خارجي:10U من إنزيم تغطية فيروس Vaccinia مع 1μg LA-Hind III لهضم الحمض النووي عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة لا ينتج عنه أي تحلل كما هو محدد بواسطة الفصل الكهربائي لهلام الاغاروز.

نوكلياز داخلي:10U من إنزيم تغطية فيروس Vaccinia مع 1μg αDNA عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة لا ينتج عنه أي تحلل كما هو محدد بواسطة الفصل الكهربائي لهلام الاغاروز.

نيكاز:10U من إنزيم تغطية فيروس Vaccinia مع 1 ميكروغرام من pBR322 عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة لا ينتج عنه أي تدهور كما هو محدد بواسطة الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز.

رناسي:10U من إنزيم تغطية فيروس Vaccinia مع 1.6 ميكروغرام MS2 RNA لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية لا ينتج عنه أي تدهور كما هو محدد بواسطة الفصل الكهربائي لهلام الاغاروز.

1.الحمض النووي القولوني:يتم فحص 10U من فيروس Vaccinia Capping Enzyme بحثًا عن وجود الحمض النووي الجينومي لـ E. coli باستخدام TaqMan qPCR مع الاشعال الخاصة بموضع E. coli 16S rRNA.إن تلوث الحمض النووي الجينومي للإشريكية القولونية هو 1 جينوم للإشريكية القولونية.

2.بكتيرية السموم الداخلية: اختبار LAL، وفقًا لدستور الأدوية الصيني IV طبعة 2020، طريقة اختبار حدود الهلام، القاعدة العامة (1143).يجب أن يكون محتوى السموم الداخلية البكتيرية ≥10 EU/mg.

نظام التفاعل وشروطه

1. بروتوكول السد (حجم التفاعل: 20 ميكرولتر)

ينطبق هذا الإجراء على تفاعل السد لـ 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي (≥100 nt) ويمكن زيادته وفقًا للمتطلبات التجريبية.

I) الجمع بين 10μg RNA وNuclease خالية من H2O في أنبوب microfuge 1.5 مل إلى الحجم النهائي من 15.0 ميكرولتر.* 10 × المخزن المؤقت للتغطية: 0.5 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك، 50 ملي مولار بوكل، 10 ملي مولتر MgCl2، 10 ملي مولار DTT، (25 درجة مئوية، الرقم الهيدروجيني 8.0)

2) قم بتسخينه عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق يليه حمام جليدي لمدة 5 دقائق.

3) أضف المكونات التالية بالترتيب المحدد

*10 × المخزن المؤقت للتغطية: 0.5 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك، 50 ملي مولار بوكل، 10 ملي مولتر MgCl2، 10 ملي مولار DTT، (25 درجة مئوية، الرقم الهيدروجيني 8.0)

4) احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، توج الآن RNA وجاهزة للتطبيقات النهائية.

2.5 محطة رد فعل العلامات (حجم التفاعل: 20 ميكرولتر)

تم تصميم هذا البروتوكول لتسمية الحمض النووي الريبي (RNA) الذي يحتوي على ثلاثي الفوسفات 5' ويمكن زيادته وفقًا للطلبات.سوف تتأثر كفاءة دمج التسمية بنسبة المولي من الحمض النووي الريبي: GTP، فضلا عن محتوى GTP في عينات الحمض النووي الريبي.

1) الجمع بين كمية مناسبة من الحمض النووي الريبي وH2O خالية من نوكلياز في أنبوب microfuge 1.5 مل إلى الحجم النهائي من 14.0 ميكرولتر.

2) قم بتسخينه عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق يليه حمام جليدي لمدة 5 دقائق.

3) أضف المكونات التالية بالترتيب المحدد.

** يشير GTP MIX إلى GTP وعدد صغير من العلامات.لمعرفة تركيز GTP، راجعإلى الملاحظة 3.

4) احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، تم الآن وضع علامة على نهاية RNA 5' وجاهزة للتحويل إلى المصب

التطبيقات

1. وضع حد أقصى مرنا قبل فحوصات الترجمة/الترجمة في المختبر

2. وضع العلامات على 5´ نهاية مرنا

ملاحظات حول الاستخدام

1.يؤدي تسخين محلول الحمض النووي الريبي (RNA) قبل الحضانة باستخدام إنزيم Vaccinia Capping إلى إزالة البنية الثانوية في الطرف 5 من النص.قم بتمديد الوقت إلى 60 دقيقة للنصوص ذات النهايات الخماسية المعروفة عالية التنظيم.

2. يجب تنقية الحمض النووي الريبي (RNA) المستخدم في تفاعلات السد قبل الاستخدام وتعليقه في الماء الخالي من النيوكلياز.يجب ألا يكون EDTA موجودًا ويجب أن يكون المحلول خاليًا من الأملاح.

3. لوضع العلامات على نهاية 5´، يجب أن يكون إجمالي تركيز GTP حوالي 1-3 أضعاف التركيز المولي للرنا المرسال في التفاعل.

4. يمكن زيادة أو تقليل حجم نظام التفاعل وفقًا للحجم الفعلي.