M-MLV النسخ العكسي
يتم الحصول على النسخ العكسي RevScript عن طريق تكنولوجيا الهندسة الوراثية.لديها قدرة أعلى على تخليق [كدنا]، والاستقرار الحراري والحد من درجة حرارة التفاعل (تصل إلى 60 درجة مئوية).منتج [كدنا] المركب يصل إلى 10 كيلو بايت.إنه يعزز تقارب القوالب وهو مناسب للنسخ العكسي لقوالب الحمض النووي الريبي (RNA) ذات البنية الثانوية المعقدة أو الجينات ذات النسخ المنخفضة.
عناصر
| عنصر | HC2003 ب-01 (10000 وحدة) | HC2003 ب-02 (5*10,000U) | HC2003 ب-03 (200000U) |
| RevScript الناسخ العكسي (200U/ميكروليتر) | 50 ميكرولتر | 5 × 50 ميكرولتر | 1 مل |
| 5 × المخزن المؤقت RevScript | 250 ميكرولتر | 1.25 مل | 5 مل |
حالة التخزين
يجب تخزين هذا المنتج في درجة حرارة -25 درجة مئوية إلى -15 درجة مئوية لمدة عامين.
تعريف الوحدة
تدمج وحدة واحدة 1 نانومول من dTTP في مادة غير قابلة للذوبان في الحمض في 10 دقائق عند 37 درجة مئوية باستخدام Oligo(dT) كبادئات.
إعداد رد الفعل
1. تمسخ قالب الحمض النووي الريبي (هذه الخطوة اختيارية، يساعد تمسخ قالب الحمض النووي الريبي (RNA) على فتح الهياكل الثانوية، مما سيؤدي إلى تحسين إنتاجية [كدنا] الأولى.)
| عناصر | مقدار (ميكرولتر) |
| ريبونوكلياز الحرة ddH2O | إلى 13 |
| نسبة ضئيلة (DT)18 (50 ميكرومول/لتر) أو التمهيدي العشوائي (50 ميكرومول / لتر) أو الاشعال الجيني المحدد (2 ميكرومول / لتر) | 1 |
| أو 1 | |
| أو 1 | |
| قالب الحمض النووي الريبي | Xa |
ملحوظات:
1) أ: إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA): 1-5 ميكروغرام أو mRNA: 1-500 نانوغرام
2) يتم التحضين عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم ينقل على الثلج مباشرة ليبرد لمدة دقيقتين.الطرد المركزي القصير لجمع سائل التفاعل، إضافة محلول تفاعل النسخ العكسي كما هو موضح في الجدول التالي.ماصة بلطف لخلط.
1. تحضير خليط التفاعل (حجم 20 ميكرولتر)
| عناصر | مقدار (ميكرولتر) |
| خليط الخطوة السابقة | 13 |
| 5 × عازلة | 4 |
| مزيج dNTP (10 نانومول/لتر) | 1 |
| النسخ العكسي (200 وحدة/ميكروليتر) | 1 |
| مثبط RNase (40 وحدة/ميكروليتر) | 1 |
1.تنفيذ رد الفعل في ظل الظروف التالية:
| درجة الحرارة (درجة مئوية) | وقت |
| 25 درجة مئويةa | 5 دقائق |
| 42 درجة مئويةb | 15-30 دقيقة |
| 85 درجة مئويةc | 5 دقائق |
ملحوظات:
1) أ.التحضين عند 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق مطلوب فقط لاستخدام السداسيات العشوائية.يرجى تخطي هذه الخطوة عند استخدام Oligo (dT)18أو التمهيدي الجيني المحدد.
2) ب.درجة حرارة النسخ العكسي الموصى بها هي 42 درجة مئوية، بالنسبة للقوالب ذات الهياكل الثانوية المعقدة أو المحتوى العالي من GC، يوصى برفع درجة حرارة التفاعل إلى 50-55 درجة مئوية.
3) ج.التسخين عند 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتعطيل إنزيم النسخ العكسي.
4) يمكن استخدام المنتج مباشرة في تفاعلات PCR أو qPCR، أو تخزينه عند -20 درجة مئوية للتخزين على المدى القصير.يوصى بتقسيم المنتجات وتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأمد.تجنب التجميد والذوبان المتكرر.
5) المنتج مناسب لخطوة واحدة RT-qPCR، فمن المستحسن إضافة 10-20 U الناسخ العكسي لكل نظام تفاعل 25μL، أو زيادة كمية الناسخ العكسي تدريجيًا وفقًا للحالة الفعلية.
ملحوظات
1.يرجى الحفاظ على نظافة المنطقة التجريبية؛يجب ارتداء القفازات والأقنعة النظيفة أثناء التشغيل.يجب أن تكون جميع المواد الاستهلاكية المستخدمة في التجربة خالية من RNase لمنع تلوث RNase.
ينبغي تنفيذ الإجراءات 2.All على الجليد لمنع تدهور الحمض النووي الريبي.
3. يوصى بعينات الحمض النووي الريبي عالية الجودة لضمان كفاءة عالية في النسخ العكسي.
4. هذا المنتج مخصص للاستخدام البحثي فقط.
5.يرجى العمل باستخدام معاطف المختبر والقفازات التي تستخدم لمرة واحدة، من أجل سلامتك.
