RTL النسخ العكسي
إن إنزيم النسخ العكسي RTL عبارة عن بوليميريز DNA يعتمد على قالب RNA ويفتقر إلى نشاط نوكلياز 3'→5' وله نشاط RNase H.يمكن لهذا الإنزيم استخدام الحمض النووي الريبي (RNA) كقالب لتجميع شريط مكمل من الحمض النووي، والذي يمكن تطبيقه على تخليق [كدنا] الأول، خاصة بالنسبة لـ RT-LAMP (التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة).بالمقارنة مع RTL النسخ العكسي 1.0، تم تحسين الحساسية بشكل ملحوظ، والثبات الحراري أقوى، والتفاعل عند 65 درجة مئوية أكثر استقرارًا.يمكن استخدام إنزيم النسخ العكسي RTL (الخالي من الجلسرين) لتحضير المستحضرات المجففة بالتجميد، وكواشف RT-LAMP المجففة بالتجميد، وما إلى ذلك.
تعريف الوحدة
تدمج وحدة واحدة 1 نانومول من dTTP في مادة قابلة للترسيب الحمضي في 20 دقيقة عند 50 درجة مئوية باستخدام poly(A)•oligo(dT)25 كقالب تمهيدي.
عناصر
| عنصر | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| إنزيم النسخ العكسي RTL (خالي من الجلسرين) (15 وحدة/ميكروليتر) | 0.1 مل | 1 مل | 10 مل |
| 10×HC RTL عازلة | 1.5 مل | 4×1.5 مل | 5×10 مل |
| MgSO4 (100 مم) | 1.5 مل | 2×1.5 مل | 3×10 مل |
حالة التخزين
النقل تحت 0 درجة مئوية ويتم تخزينه في -25 درجة مئوية ~ -15 درجة مئوية.
رقابة جودة
- النشاط المتبقي منEنوكلياز:يُظهر تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على 1 ميكروغرام من αDNA و15 وحدة من RTL2.0 المحتضنة لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية نفس نمط التحكم السلبي بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام.
- النشاط المتبقي مننوكلياز خارجي:يُظهر تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على 1 ميكروغرام من Hind Ⅲ αDNA المهضوم و15 وحدة من RTL2.0 المحتضنة لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية نفس نمط التحكم السلبي بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام.
- النشاط المتبقي مننيكاسي:يُظهر تفاعل 50 ميكرولتر يحتوي على 1 ميكروغرام من pBR322 supercoiled و15 وحدة من RTL2.0 المحتضنة لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية نفس نمط التحكم السلبي بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام.
- النشاط المتبقي منرناسي:يُظهر تفاعل 10 ميكرولتر يحتوي على 0.48 ميكروغرام من MS2 RNA و15 وحدة من RTL2.0 المحتضنة لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية نفس نمط التحكم السلبي بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام.
- بكتريا قولونية gالحمض النووي:تقاس ببكتريا قولونيةمجموعات الكشف عن HCD المحددة، 15 وحدة من RTL2.0 تحتوي على أقل من 1بكتريا قولونيةالجينوم.
إعداد رد الفعل
بروتوكول توليف [كدنا].
| عناصر | مقدار |
| قالب الحمض النووي الريبوزي أ | خياري |
| Oligo (dT) 18 ~ 25 (50uM) أو مزيج تمهيدي عشوائي (60uM) | 2 ميكرولتر |
| مزيج dNTP (10 مم لكل منهما) | 1 ميكرولتر |
| مثبط RNase (40U/ul) | 0.5 ميكرولتر |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/ul) | 0.5 ميكرولتر |
| 10×HC RTL عازلة | 2 ميكرولتر |
| مياه خالية من نوكلياز | ما يصل إلى 20 ميكرولتر |
ملحوظات:
1) الجرعة الموصى بها من إجمالي RNA هي 1ng~1μg
2) كانت الجرعة الموصى بها من mRNA هي 50 نانوغرام ~ 100 نانوغرام
الحرارية-شروط ركوب الدراجات للروتين رد فعل:
| درجة الحرارة (درجة مئوية) | وقت |
| 25 درجة مئويةa | 5 دقائق |
| 55 درجة مئوية | 10 دقائقb |
| 80 درجة مئوية | 10 دقائق |
ملحوظات:
1) إذا تم استخدام مزيج التمهيدي العشوائي، خطوة الحضانة عند 25 درجة مئوية.
2) إذا تم استخدام مزيج التمهيدي المستهدف، خطوة الحضانة عند 55 درجة مئوية لمدة 10 ~ 30 دقيقة.
بروتوكول RT-LAMP
| عناصر | مقدار | التركيز النهائي |
| قالب الحمض النووي الريبي | خياري | ≥10 نسخ |
| مزيج dNTP (10 مم) | 3.5 ميكرولتر | 1.4 ملم |
| بادئات FIP/BIP (25×) | 1 ميكرولتر | 1.6 ميكرومتر |
| بادئات F3/B3 (25×) | 1 ميكرولتر | 0.2 ميكرومتر |
| بادئات LoopF/LoopB (25×) | 1 ميكرولتر | 0.4 ميكرومتر |
| مثبط RNase (40 وحدة/ميكروليتر) | 0.5 ميكرولتر | 20 وحدة/رد فعل |
| RTL النسخ العكسي 2.0 (15 وحدة/ميكروليتر) | 0.5 ميكرولتر | 7.5 وحدة/رد فعل |
| Bst V2 بوليميريز الحمض النووي (8U/ميكرولتر) | 1 ميكرولتر | 8 ش/رد فعل |
| MgSO4 (100 مم) | 1.5 ميكرولتر | 6 ملم (إجمالي 8 ملم) |
| 10 × HC RTL Buffer (أو 10 × HC Bst V2 Buffer) | 2.5 ميكرولتر | 1 × (2 ملم Mg2+) |
| مياه خالية من نوكلياز | ما يصل إلى 25 ميكرولتر | - |
ملحوظات:
1) مزيج من دوامة وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لجمع.حضانة بدرجة حرارة ثابتة عند 65 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
2) المخزنان المؤقتان قابلان للتشغيل المتبادل ولهما نفس التركيب.
ملحوظات
1. سيشكل هذا المنتج مادة صلبة بيضاء عند تخزينه في درجة حرارة -20 درجة مئوية.أخرجه من -20 درجة مئوية وضعه على الثلج لمدة 10 دقائق تقريبًا.بعد الذوبان، يمكن استخدامه عن طريق الرج والخلط.
2. يمكن تخزين منتج [كدنا] عند -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية أو استخدامه على الفور لتفاعل PCR.
3. لمنع تلوث RNase، يرجى الحفاظ على نظافة المنطقة التجريبية، وارتداء القفازات والأقنعة النظيفة أثناء التشغيل.
