مجموعة إندوفري بلازميد ماكسي
هذه المجموعة مناسبة لاستخراج 150 - 300 مل من المحلول البكتيري المزروع طوال الليل، باستخدام طريقة تحلل قلوية SDS محسنة لتحلل البكتيريا.يتم دمج المستخلص الخام بشكل انتقائي مع جهاز إزالة السموم الداخلية الفريد وفصله عن طريق الطرد المركزي لإزالة السموم الداخلية.بعد ذلك، يرتبط غشاء هلام السيليكا بشكل انتقائي بالحمض النووي البلازميد في المحلول في ظل ظروف عالية الملح ومنخفضة الرقم الهيدروجيني.ويتبع ذلك إضافة محلول غسيل لإزالة الشوائب والمكونات البكتيرية الأخرى.وأخيراً، يتم استخدام محلول شطف منخفض الملح وعالي الرقم الهيدروجيني لإزالة الحمض النووي البلازميد النقي من غشاء مصفوفة السيليكون.يستخدم غشاء هلام السيليكا غشاء امتزاز خاص، وفرق كمية الامتزاز بين العمود والعمود صغير جدًا والتكرار جيد.ليست هناك حاجة إلى الفينول والكلوروفورم والكواشف السامة الأخرى، وكذلك خطوات ترسيب الإيثانول.يمكن استخدام هذه المجموعة لاستخراج 0.2 - 1.5 ملجم من DNA البلازميد النقي عالي النسخ بسرعة، بمعدل استخلاص يتراوح بين 80% -90%.تستخدم المجموعة صيغة عملية فريدة لإزالة السموم الداخلية، ومحتوى السموم الداخلية منخفض للغاية وتأثير ترنسفكأيشن الخلايا ممتاز.يمكن استخدام البلازميد المستخرج مباشرة في هضم الإنزيم، وتفاعل البوليميراز المتسلسل، والنسخ المختبري، والتحويل، والتسلسل، وتجارب البيولوجيا الجزيئية الأخرى.
شروط التخزين
يجب تخزين RNaseA عند درجة حرارة -30 ~ -15 درجة مئوية ونقله عند درجة حرارة ≥0 درجة مئوية.
يمكن تخزين جهاز إزالة السموم الداخلية في درجة حرارة 2 ~ 8 درجة مئوية لمدة شهر واحد، وتخزينه في درجة حرارة -30 ~ -15 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.ويتم نقلها عند درجة حرارة ≥0 درجة مئوية.
يجب تخزين المكونات الأخرى في درجة حرارة الغرفة (15 ~ 25 درجة مئوية) ونقلها في درجة حرارة الغرفة.
عناصر
| عناصر | 10RXNS |
| رناسي أ | 750 ميكرولتر |
| المخزن المؤقت P1 | 75 مل |
| المخزن المؤقت P2 | 75 مل |
| المخزن المؤقت P4 | 75 مل |
| زبال السموم الداخلية | 25 مل |
| العازلة PW | 2 × 22 مل |
| السل العازلة | 20 مل |
| أعمدة FastPure DNA Maxi (كل منها في أنبوب مجموعة سعة 50 مل) | 10 |
| أنبوب جمع خالي من السموم الداخلية | 2 × 5 |
رناسي:10 ملغ/مل، يستخدم لإزالة الحمض النووي الريبي.
المخزن المؤقت P1:المخزن المؤقت للتعليق البكتيري، أضف RNaseA إلى المخزن المؤقت P1 قبل الاستخدام الأول.
المخزن المؤقت P2:المخزن المؤقت للتحلل البكتيري (الذي يحتوي على SDS/NaOH).
المخزن المؤقت P4:تحييد العازلة.
زبال السموم الداخلية:إزالة السموم الداخلية بشكل فعال من مستخلص البلازميد الخام.
المخزن المؤقت PW:غسل العازلة، إضافة الحجم المنصوص عليه من الإيثانول قبل الاستخدام الأول.
السل العازل:شطف العازلة.
أعمدة FastPure DNA Maxi:أعمدة امتصاص الحمض النووي البلازميد.
أنابيب التجميع 50 مل:أنابيب جمع الترشيح.
أنبوب التجميع الخالي من السموم الداخلية:أنابيب جمع الحمض النووي البلازميد.
المواد المعدة
الإيثانول المطلق والأيزوبروبانول و50 مل من أنابيب الطرد المركزي ذات القاع الدائري و50 مل خالية من السموم الداخليةأنابيب الطرد المركزي.
التطبيقات
هذا المنتج مناسب لاستخراج البلازميدات على نطاق واسع من 150 - 300 مل من المحلول البكتيريمثقف بين عشية وضحاها.
عملية التجربة
1. خذ 150 - 200 مل (لا يزيد عن 300 مل) من المحلول البكتيري المزروع طوال الليل ثم قم بالطرد المركزي فيحوالي 11000 دورة في الدقيقة (12000 × جم) لمدة 1-2 دقيقة.تجاهل المادة طافية وجمع البكتيريا.
Δ عند جمع أكثر من 50 مل من المحلول البكتيري، يمكن جمع البكتيريا عن طريق إضافة المحلول البكتيري والطرد المركزي والتخلص من المادة الطافية وخطوات أخرى في نفس أنبوب الـ 50 مل من أجل
عدة مرات.
2. أضف 7.5 مل من المخزن المؤقت P1 (يرجى التحقق مما إذا تمت إضافة RNaseA إلى المخزن المؤقت P1) إلى جهاز الطرد المركزيأنبوب يحتوي على البكتيريا وتخلط جيدا عن طريق الدوامة أو الأنابيب.
Δ إن إعادة التعليق الكامل للبكتيريا في هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية لإنتاجه، ويجب ألا يكون هناك أي كتل بكتيرية بعد إعادة التعليق.إذا كانت هناك كتل بكتيرية لم يتم خلطها جيدًا، فسوف يؤثر ذلك على التحلل، مما يؤدي إلى انخفاض الإنتاجية والنقاء.إذا كان OD600 للمحلول البكتيري هو 0.65، فمن المستحسن استخدام 7.5 مل من المخزن المؤقت P1 عند الاستخلاص من 150 مل من المحلول البكتيري؛عندما يكون OD600 0.75، يجب استخدام 8 مل من المخزن المؤقت P1 ويجب تغيير أحجام المخزن المؤقت P2 وP4 وفقًا لذلك.إذا زاد حجم المحلول البكتيري إلى 200 مل، يوصى باستخدامهيمكن زيادة حجم المخازن المؤقتة P1 وP2 وP4 بشكل متناسب.
3. أضف 7.5 مل من Buffer P2 إلى المعلق البكتيري من الخطوة 2 واخلطه بلطف لأعلى ولأسفل لمدة 6 - 8.مرات واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 4-5 دقائق.
Δ اقلب بلطف لخلط جيدا.سوف تتسبب الدوامة في تجزئة الحمض النووي الجينومي، مما يؤدي إلى شظايا الحمض النووي الجينومي في البلازميد المستخرج.في هذا الوقت، يصبح المحلول لزجًا وشفافًا، مما يدل على أن البكتيريا قد تم تحللها بالكامل.يجب ألا تتجاوز المدة 5 دقائق لتجنب تدمير البلازميدات.إذا لم يكن المحلول واضحًا، فقد يكون هناك عدد كبير جدًا من البكتيريا الناتجةتحلل غير كامل، لذلك ينبغي تقليل كمية البكتيريا بشكل مناسب.
4. أضف 7.5 مل من Buffer P4 إلى المعلق البكتيري من الخطوة 3 واقلبه على الفور برفق 6 – 8 مرات للسماح للمحلول بتحييد Buffer P2 تمامًا.في هذا الوقت، يجب أن تظهر راسب ندف أبيض.أجهزة الطرد المركزي عند أكثر من حوالي 11000 دورة في الدقيقة (12000 × جم) لمدة 10 - 15 دقيقة، ماصة المادة الطافية بعناية في أنبوب طرد مركزي جديد مستدير القاع سعة 50 مل (مُعد ذاتيًا)، وتجنبنضح الراسب الأبيض العائم.
Δ أضف المخزن المؤقت P4 واقلبه على الفور حتى يمتزج جيدًا.اترك الأنبوب واقفًا حتى يتم توزيع الراسب الأبيض بالتساوي في جميع أنحاء المحلول لمنع إنتاج الترسيب المحلي الذي قد يؤثر على التحييد.إذا لم يكن هناك راسب ندف أبيض موحد قبل الطرد المركزي وكان الطاف غير واضح بعد الطرد المركزي، يمكن أن يكون الأنبوبالطرد المركزي لمدة 5 دقائق أخرى.
5. أضف 0.1 مرة الحجم (10% من حجم المادة الطافية، حوالي 2.2 مل) من مزيل السموم الداخلية إلى المادة الطافية من الخطوة 4 واقلب المزيج.ضع المحلول في حمام جليدي أو أدخله في الثلج المجروش (أو الثلاجة) لمدة 5 دقائق حتى يتغير المحلول من عكر إلى شفاف وشفاف (أو لا يزالعكر قليلا)، وأحيانا مزيج عدة مرات.
Δ بعد إضافة مزيل الذيفان الداخلي إلى الطاف، سيصبح الطاف عكرًا ولكنيجب أن يصبح الطاف واضحًا (أو عكرًا قليلاً) بعد تبريده في حمام جليدي.
6. بعد وضع المادة الطافية في درجة حرارة الغرفة (> 25 درجة مئوية) لمدة 10 - 15 دقيقة، سوف تصبح عكرة مثلترتفع درجة حرارته إلى درجة حرارة الغرفة.ثم يجب أن يتم قلب المادة الطافية حتى تمتزج.
Δ إذا كانت درجة حرارة الغرفة أقل أو كنت ترغب في تقليل وقت الاستخراج، فيمكن احتضان المادة الطافية في حمام مائي بدرجة حرارة 37 ~ 42 درجة مئوية لمدة 5 - 10 دقائق ويمكن تنفيذ الخطوة التالية بعد المادة الطافيةيصبح عكرًا.
7. قم بالطرد المركزي للطاف عند حوالي 11000 دورة في الدقيقة (12000 × جم) لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة الغرفة (يجب أن تكون درجة الحرارة أكبر من 25 درجة مئوية) لفصل الطور.تحتوي الطور المائي العلوي على الحمض النووي بينما تحتوي طبقة الطور الزيتي الأزرق السفلي على ذيفان داخلي وشوائب أخرى.نقلالمرحلة المائية التي تحتوي على الحمض النووي إلى أنبوب جديد وتخلص من الطبقة الزيتية.
Δ يجب أن تكون درجة الحرارة أثناء الطرد المركزي أكثر من 25 درجة مئوية، حيث لا يحدث فصل الطور الفعالتحدث إذا كانت درجة الحرارة منخفضة جدًا.
Δ إذا لم يكن فصل الطور فعالاً، فيمكن تعديل درجة حرارة الطرد المركزي إلى 30 درجة مئويةيمكن زيادة وقت الطرد المركزي إلى 15 دقيقة.
Δ لا تمتص الطبقة الدهنية الزرقاء لأنها تحتوي على سموم داخلية وشوائب أخرى.
آلية
إعادة تعليق تحلل تحييد
◇ أضف 7.5 مل من المخزن المؤقت P1
◇ أضف 7.5 مل من المخزن المؤقت P2
◇ إضافة 7.5 مل عازل P4
إزالة السموم الداخلية
◇ أضف 0.1 مرة من حجم المادة الطافية لـ Endotoxin Scavenger
الربط والغسيل
◇ أضف 0.5 مرة حجم الأيزوبروبانول
◇ أضف 10 مل Buffer PW
◇ أضف 10 مل Buffer PW
شطف
◇ أضف 1 – 2 مل من السل العازل أو ddH2O الخالي من السموم الداخلية
