M-MLV نيوسكريبت النسخ العكسي
Neoscript Reverse Transcriptase هو نسخة عكسية تم الحصول عليها عن طريق فحص طفرة جين M-MLV لأصل فيروس سرطان الدم الفأري Moloney وتعبيره في E.coli.يزيل الإنزيم نشاط RNase H، ويتمتع بقدرة تحمل أعلى لدرجة الحرارة، وهو مناسب للنسخ العكسي عند درجات الحرارة العالية.لذلك، فهو مفيد للتخلص من التأثيرات غير المواتية للبنية عالية المستوى للحمض النووي الريبي (RNA) والعوامل غير المحددة على تخليق [كدنا]، وله استقرار أعلى وقدرة على توليف النسخ العكسي.يتمتع الإنزيم بثبات أعلى وقدرة على تخليق النسخ العكسي.
عناصر
1.200 وحدة / ميكرولتر من نيوسكريبت العكسي
2.5 × عازلة أولية (اختياري)
* 5 × المخزن المؤقت للشريط الأول لا يحتوي على dNTP، يرجى إضافة dNTPs عند إعداد نظام التفاعل
التطبيق الموصى به
1.خطوة واحدة qRT-PCR.
2.الكشف عن فيروسات الحمض النووي الريبي.
حالة التخزين
-20 درجة مئوية للتخزين طويل الأمد، يجب خلطه جيدًا قبل الاستخدام، وتجنب التجميد والذوبان المتكرر.
تعريف الوحدة
تتضمن وحدة واحدة 1 نانومول من dTTP في 10 دقائق عند 37 درجة مئوية باستخدام poly(A)•oligo(dT)25كقالب/التمهيدي.
رقابة جودة
1.SDS-PAGE نقاء الكهربي أكبر من 98%.
2.حساسية التضخيم، والتحكم من دفعة إلى دفعة، والاستقرار.
3.لا يوجد نشاط نوكلياز خارجي، ولا نوكلياز خارجي المنشأ أو تلوث نوكلياز خارجي
إعداد التفاعل لحل التفاعل المتسلسل الأول
1.تحضير خليط التفاعل
| عناصر | مقدار |
| نسبة ضئيلة (DT)12-18 التمهيدي أو التمهيدي العشوائيأ أو الاشعال الجيني المحددb | 50 بمول |
| 50 بمول (20-100 بمول) | |
| 2 بمول | |
| 10 ملم دنتب | 1 ميكرولتر |
| قالب الحمض النووي الريبي | إجمالي الحمض النووي الريبي ≥ 5 ميكروغرام؛مرنا ≥ 1 ميكروغرام |
| RNase خالية من dH2O | إلى 10 ميكرولتر |
ملحوظات:أ/ب: يرجى تحديد أنواع مختلفة من البادئات وفقًا لاحتياجاتك التجريبية.
2.يسخن عند درجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم يبرد بسرعة على الثلج لمدة دقيقتين.
3.أضف المكونات التالية إلى النظام أعلاه إلى إجمالي حجم 20 ميكرولتر واخلطها بلطف:
| عناصر | مقدار (ميكرولتر) |
| 5 × عازلة من الدرجة الأولى | 4 |
| نيوسكريبت العكسي (200 وحدة / ميكرولتر) | 1 |
| مثبط RNase (40 وحدة/ميكروليتر) | 1 |
| RNase خالية من dH2O | إلى 20 ميكرولتر |
4. يرجى إجراء التفاعل وفقًا للشروط التالية:
(1) إذا تم استخدام التمهيدي العشوائي، فيجب إجراء التفاعل عند 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، ثم عند 50 درجة مئوية لمدة 30 إلى 60 دقيقة؛
(2) إذا تم استخدام Oligo dT أو بادئات محددة، فيجب إجراء التفاعل عند 50 درجة مئوية لمدة 30 إلى 60 دقيقة.
5.قم بالتسخين عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتعطيل Neoscript Reverse Transcriptase وإنهاء التفاعل.
6.يمكن استخدام منتجات النسخ العكسي مباشرة في تفاعل PCR وتفاعل PCR الكمي الفلوري، أو تخزينها عند -20 درجة مئوية لفترة طويلة.
بي سي آر رالفعل:
1.تحضير خليط التفاعل
| عناصر | تركيز |
| 10 × PCR Buffer (dNTP مجاني، Mg²+ مجاني) | 1× |
| dNTPs (10 ملم لكل dNTP) | 200 ميكرومتر |
| 25 ملي مجكل2 | 1-4 ملم |
| طق بوليميريز الحمض النووي (5U/ميكروليتر) | 2-2.5 ش |
| التمهيدي 1 (10 ميكرومتر) | 0.2-1 ميكرومتر |
| التمهيدي 2 (10 ميكرومتر) | 0.2-1 ميكرومتر |
| نموذجأ | ≥10% محلول التفاعل المتسلسل الأول (2 ميكرولتر) |
| ddH2O | إلى 50 ميكرولتر |
ملحوظات:ج: إذا تمت إضافة كمية كبيرة جدًا من محلول التفاعل المتسلسل الأول، فقد يتم تثبيط تفاعل PCR.
2.إجراء تفاعل PCR
| خطوة | درجة حرارة | وقت | دورات |
| ما قبل تمسخ الطبيعة | 95 درجة مئوية | 2-5 دقائق | 1 |
| تمسخ | 95 درجة مئوية | 10-20 ثانية | 30-40 |
| التلدين | 50-60 درجة مئوية | 10-30 ثانية | |
| امتداد | 72 درجة مئوية | 10-60 ثانية |
ملحوظات
1.مناسبة لتحسين درجة حرارة النسخ العكسي في نطاق 42 درجة مئوية ~ 55 درجة مئوية.
2.لديها استقرار أفضل، ومناسبة لتضخيم النسخ العكسي لدرجات الحرارة العالية.بالإضافة إلى ذلك، فهو مناسب للمرور بكفاءة عبر المناطق الهيكلية المعقدة للحمض النووي الريبي (RNA).كما أنهمناسبة للكشف الكمي المضان المتعدد RT-PCR بخطوة واحدة.
3.توافق جيد مع مختلف إنزيمات تضخيم PCR ومناسب لتفاعلات RT-PCR عالية الحساسية.
4.مناسبة للتفاعل الكمي RT-PCR ذو الحساسية العالية بخطوة واحدة، مما يحسن بشكل فعال معدل اكتشاف التركيز المنخفض للقوالب.
5.مناسبة لبناء مكتبة [كدنا].
