يوراسيل الحمض النووي جليكوزيلاز
Uracil-DNA Glycosylase (UNG أو UDG) هو استنساخ مؤتلف من E.coli بوزن جزيئي قدره 25 كيلو دالتون.إنه يحفز إطلاق اليوراسيل الحر من الحمض النووي المفرد والمزدوج الذي تقطعت به السبل والذي يحتوي على اليوراسيل، وهو غير نشط ضد الحمض النووي الريبي (RNA)، ويمكن استخدامه لمنع تلوث منتجات تضخيم PCR.يعتمد مبدأ العمل على حقيقة أنه إذا تم استبدال dUTP بـ dTTP في تفاعل PCR وتم تشكيل منتج تضخيم PCR يحتوي على قواعد duU، فيمكن للإنزيم أن يكسر بشكل انتقائي الرابطة الجليكوسيدية لقواعد U في السلاسل المفردة والمزدوجة الحمض النووي وتحلل منتج تضخيم PCR.
التطبيق الموصى به
تضخيم منع التلوث
حالة التخزين
-20 درجة مئوية للتخزين طويل الأمد، يجب خلطه جيدًا قبل الاستخدام، وتجنب التجميد والذوبان المتكرر.
المخزن المؤقت للتخزين
20 ملم تريس-حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.0)، 150 ملم كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، 1 ملم DTT، مثبت، 50٪ جلسرين.
تعريف الوحدة
كمية الإنزيم المطلوبة لتحلل 1 ميكروجرام من الحمض النووي المفرد الذي يحتوي على قواعد ثنائي اليورانيوم في ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية هي وحدة واحدة.
رقابة جودة
1.SDS-PAGE نقاء الكهربي أكبر من 98%
2.حساسية التضخيم، والتحكم من دفعة إلى دفعة، والاستقرار
3.بعد معالجة 1U من UNG عند 50 درجة مئوية لمدة دقيقتين، يجب أن يتحلل القالب الذي يحتوي على U أقل من 103 نسخة تمامًا ولا يمكن إنتاج أي منتج تضخيم.
4.لا يوجد نشاط نووي خارجي
تعليمات
| عناصر | الحجم (ميكروليتر) | التركيز النهائي |
| 10 × PCR Buffer (خالي من dNTP، Mg²+حر) | 5 | 1× |
| dUTPs (dCTP، dGTP، dATP) | - | 200 ميكرومتر |
| dUTP (استبدال dTTP) | - | 200-600 ميكرومتر |
| 25 ملي مجكل2 | 2-8 ميكرولتر | 1-4 ملم |
| 5 وحدة/ميكروليتر طاق | 0.25 | 1.25 ش |
| 5 وحدة/ميكروليتر UNG | 0.25 (0.1-0.5) | 0.25 يو (0.1-0.5) |
| 25 × خليط برايمرأ | 2 | 1× |
| نموذج | - | <1 ميكروجرام/رد فعل |
| ddH₂O | إلى 50 | - |
ملحوظة: ج: إذا تم استخدامه لـ qPCR/qRT-PCR، فيجب إضافة مسبار الفلورسنت إلى نظام التفاعل.عادة، تركيز التمهيدي النهائي من 0.2 ميكرومتر يمكن أن يعطي نتائج جيدة؛عندما يكون أداء التفاعل ضعيفًا، يمكن تعديل تركيز التمهيدي في نطاق 0.2-1 ميكرومتر.عادة، يتم تحسين تركيز المسبار في حدود 0.1-0.3 ميكرومتر.يمكن إجراء تجارب تدرج التركيز للعثور على أفضل مزيج من التمهيدي والمسبار.
ملحوظات
1.يمكن استخدام إنزيم UNG لإزالة منتجات تضخيم dUTP الملوثة من نظام التفاعل قبل تفاعل تضخيم PCR، ثم لتجنب النتائج الإيجابية الكاذبة بسبب تلوث المنتج.
2.درجة الحرارة المثالية لإنزيم UNG الذي سيتم استخدامه في تفاعل PCR المضاد للتلوث هي بشكل عام 50 درجة مئوية لمدة دقيقتين؛حالة التعطيل هي 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
3.تجنب التجميد المتكرر والذوبان، ولا تعرض لتقلبات كبيرة في درجات الحرارة.
4.تتمتع الجينات المختلفة المراد تضخيمها بكفاءة استخدام مختلفة لـ dUTP وحساسية لإنزيم UNG، لذلك، إذا أدى استخدام نظام UNG إلى انخفاض حساسية الكشف، فيجب تعديل نظام التفاعل وتحسينه، وإذا كنت بحاجة إلى دعم فني، فيرجى الاتصال شركتنا.
