مجموعة صغيرة لاستخراج الحمض النووي
تعتمد هذه المجموعة نظام عازل محسّن وتقنية تنقية عمود هلام السيليكا، والتي يمكنها استعادة 70 نقطة أساس - 20 كيلو بايت من أجزاء الحمض النووي من تركيزات مختلفة من جل الاغاروز TAE أو TBE.يمكن لعمود امتصاص الحمض النووي أن يمتص الحمض النووي بشكل خاص تحت ظروف الملح العالي.بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمجموعة تنقية أجزاء الحمض النووي مباشرة من منتجات PCR أو أنظمة التفاعل الأنزيمية أو منتجات الحمض النووي الخام التي تم الحصول عليها بطرق أخرى، وإزالة الشوائب مثل البروتينات والمركبات العضوية الأخرى وأيونات الملح غير العضوية وبادئات قليل النوكليوتيد.يمكنه التأكد من إمكانية اكتمال عملية التنقية خلال 10-15 دقيقة.يمكن استخدام الحمض النووي المنقى مباشرة للربط، والتحويل، وهضم الإنزيم، والنسخ في المختبر، وPCR، والتسلسل، والحقن المجهري، وما إلى ذلك.
شروط التخزين
يُخزن في درجة حرارة -15 ~ -25 درجة مئوية ويُنقل في درجة حرارة الغرفة.
عناصر
| عناصر | (100 ركنس) |
| الناتج المحلي الإجمالي العازلة | 80 مل |
| العازلة غيغاواط | 2 × 20 مل |
| شطف العازلة | 20 مل |
| FastPure DNA Mini Columns-G | 100 |
الناتج المحلي الإجمالي العازل:عازلة ربط الحمض النووي.
المخزن المؤقت غيغاواط:غسل العازلة.أضف الإيثانول المطلق بالحجم المشار إليه على الزجاجة قبل الاستخدام.
شطف العازلة:شطف.
أعمدة FastPure DNA Mini-G:أعمدة امتصاص الحمض النووي.
أنابيب التجميع 2 مل:أنابيب جمع للترشيح.
المواد المعدة
أنابيب معقمة بحجم 1.5 مل، والإيثانول المطلق والأيزوبروبانول (عندما يكون جزء الحمض النووي أقل من 100 نقطة أساس، أضف حجمًا واحدًا
الأيزوبروبانول إلى 1 حجم هلام)، حمام مائي.
عملية التجربة
أضف 80 مل من الإيثانول لتخفيف المخزن المؤقت GW كما هو موضح على البطاقة قبل الاستخدام، وخزنه في درجة حرارة الغرفة.
آلية
1. محلول تفاعل PCR
مخطط استخراج الجل: إضافة نظام استرداد محلول تفاعل PCR لحجم المخزن المؤقت المتساوي:أضف 5 أضعاف حجم المخزن المؤقت
2. الناتج المحلي الإجمالي احسب حجم الجل (100 μل يساوي 100 ملغ)
حل هلام
3. التسخين على درجة حرارة 50 ~ 55درجه مئوية
4. ربط غسل
إضافة 300 ميكروليتر من الناتج المحلي الإجمالي العازلة*
أضف 700 ميكرولتر من المخزن المؤقت GW
أضف 700 ميكرولتر من المخزن المؤقت GW
5. أزل
أضف 20 – 30 ميكرولتر من محلول الشطف أو الماء منزوع الأيونات
ملاحظات* استرداد سائل تفاعل PCR بدون هذه الخطوة
برنامج استخراج الجل
1. بعد التفريد للحمض النووي لتجزئة شظايا الحمض النووي، قم باستئصال شريط واحد من جزء الحمض النووي من هلام الاغاروز تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.من المستحسن استخدام ورق ماص لامتصاص الرطوبة الظاهرة من الجل وتقليل حجم شريحة الجل عن طريق إزالة الاغاروز الزائد قدر الإمكان.قم بوزن شريحة الجل (بدون أنبوب الطرد المركزي الصغير) لحساب حجمها: يبلغ حجم شريحة الجل 100 ملغ حوالي 100 ميكرولتر، على افتراض أن الكثافة 1 جم/مل.
2. أضف حجمًا متساويًا من الناتج المحلي الإجمالي العازل، واحضنه عند درجة حرارة 50 إلى 55 درجة مئوية لمدة 7-10 دقائق (وفقًا لحجم الجل، اضبط وقت الحضانة حتى يذوب الجل تمامًا).عكس الأنبوب 2 مرات أثناء الحضانة.
Δ لن تؤثر إضافة 1-3 مجلدات من الناتج المحلي الإجمالي العازل على كفاءة استعادة الحمض النووي.إذا كان جزء الحمض النووي المراد استرداده أقل من 100 نقطة أساس، فيجب إضافة 3 مجلدات من الناتج المحلي الإجمالي العازل؛عندما تذوب شريحة الجل تمامًا، أضف حجمًا واحدًا من الأيزوبروبانول واخلطه جيدًا، ثم انتقل إلى الخطوة التالية.
3. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة لجلب العينة إلى قاع الأنبوب، أدخل FastPure DNA Mini Columns-G في أنابيب التجميع 2 مل، ثم انقل المحلول بعناية بحد أقصى 700 ميكرولتر مرة واحدة
الوقت لأعمدة الترشيح، وأجهزة الطرد المركزي عند 12000 دورة في الدقيقة (13800 X ج) لمدة 30-60 ثانية.
4. تجاهل الترشيح وإضافة 300 ميكرولتر من الناتج المحلي الإجمالي العازلة إلى العمود، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة، وأجهزة الطرد المركزي عند 12000 دورة في الدقيقة (13800 X ز) لمدة 30-60 ثانية.
5. تخلص من المرشح وأضف 700 ميكرولتر من المخزن المؤقت GW (تحقق مما إذا تمت إضافة الإيثانول المطلق مقدمًا!) إلى العمود، وأجهزة الطرد المركزي عند 12000 دورة في الدقيقة (13800 X جم) لمدة 30-60 ثانية.
Δ الرجاء إضافة Buffer GW حول جدار عمود الامتزاز، أو إضافة Buffer GW الغطاء الخلفي وخلطه رأسًا على عقب لمدة 2 - 3 مرات للمساعدة في طرد الملح الملتصق بجدار الأنبوب بشكل كامل.
6. كرر الخطوة 5.
Δ يمكن أن يضمن الشطف باستخدام Buffer GW مرتين إزالة الملح بالكامل وإزالة التأثير على التجارب اللاحقة.
تخلص من المرشح والطرد المركزي العمود الفارغ عند 12000 دورة في الدقيقة (13800 X جم) لمدة دقيقتين.
8. إدراج العمود في أنبوب microcentrifuge نظيف 1.5 مل، وإضافة 20-30 ميكرولتر من شطف العازلة إلى وسط غشاء العمود، واحتضان لمدة 2 دقيقة، ثم الطرد المركزي عند 12000 دورة في الدقيقة (13800 X ز) for1 دقيقة.تجاهل العمود، وتخزين الحمض النووي الذي تم الحصول عليه في -20.
Δ قد يكون نقل المادة الطافية من الخطوة 8 إلى العمود للشطف مرة أخرى والتسخين المسبق لمخزن الشطف المؤقت إلى 55 (عندما يكون جزء الحمض النووي أكبر من 3 كيلو بايت) مفيدًا لزيادة كفاءة الاسترداد.
برنامج استعادة منتجات PCR
ينطبق هذا البروتوكول على تنقية أجزاء الحمض النووي من منتجات PCR ونظام التفاعل الأنزيمي ومنتجات الحمض النووي الخام الأخرى (بما في ذلك الحمض النووي الجيني).يمكن لهذا المحلول إزالة النيوكليوتيدات المختلفة والبادئات والدايمرات الأولية وجزيئات الملح والإنزيمات والشوائب الأخرى بكفاءة.
1. لفترة وجيزة منتجات PCR الطرد المركزي، ومحلول التفاعل الأنزيمي، وغيرها من المنتجات الخام DNA.تقدير حجمها باستخدام ماصة ونقلها إلى أنبوب معقم سعة 1.5 مل أو 2 مل.أضف ddH2O حتى يصل الحجم إلى 100 ميكرولتر؛بينما بالنسبة للحمض النووي الجينومي عالي التركيز، فإن التخفيف إلى 300 ميكرولتر باستخدام ddH2O سيساعد على تحسين كفاءة الاسترداد.
2. أضف 5 مجلدات من إجمالي الناتج المحلي الاحتياطي، واخلطها جيدًا عن طريق العكس أو الدوامة.إذا كان جزء الحمض النووي محل الاهتمام > 100 نقطة أساس، فيجب إضافة 1.5 مجلدات إضافية (عينات + الناتج المحلي الإجمالي العازل) من الإيثانول.
3. أدخل العمود مرة أخرى في أنبوب التجميع، وانقل الخليط إلى العمود، وأجهزة الطرد المركزي عند 12000 دورة في الدقيقة (13800 × جم) لمدة 30 - 60 ثانية.إذا كان حجم الحل المختلط > 700 ميكرولتر، ضع عمود الامتزاز مرة أخرى في أنبوب التجميع، ونقل الحل المتبقي إلى عمود الامتزاز، وأجهزة الطرد المركزي عند 12000 دورة في الدقيقة (13800 × جم) لمدة 30 – 60 ثانية.
4. يشير الأداء التالي إلى الخطوة 5 – 8 من برنامج 08- 1/Gel Extraction.
التطبيقات
تركيزات مختلفة من هلام الاغاروز TAE أو TBE؛منتجات PCR أو أنظمة التفاعل الأنزيمي أو غيرها من منتجات الحمض النووي الخام التي يتم الحصول عليها بطرق مختلفة.تراوحت الشظايا المستردة من70 نقطة أساس -20 كيلو بايت.
ملحوظات
للاستخدام البحثي فقط.ليس للاستخدام في إجراءات التشخيص.
1. أضف 80 مل من الإيثانول لتخفيف المخزن المؤقت GW كما هو موضح على البطاقة قبل الاستخدام، وخزنه في درجة حرارة الغرفة.
2. إذا كان من السهل ترسيب الناتج المحلي الإجمالي العازل أثناء التخزين في درجة حرارة منخفضة، فيمكن وضعه في درجة حرارة الغرفة لفترة من الوقت قبل الاستخدام.إذا لزم الأمر، يمكن تسخينه مسبقًا في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية حتى يذوب الراسب تمامًا، ومن ثم يمكن استخدامه بعد الخلط.
3. اضبط درجة حرارة حمام الماء على 50 ~ 55 درجة مئوية مسبقًا.
4. في الخطوة 1 من برنامج استخلاص الجل 08-1، سيؤدي تقليل حجم شريحة الهلام إلى تقليل وقت الذوبان بشكل كبير وزيادة كفاءة الاسترداد (يمكن بسهولة تحلل الحمض النووي الخطي عند تعرضه باستمرار لدرجة حرارة عالية).لا تعرض هلام الحمض النووي للأشعة فوق البنفسجية لفترة طويلة، لأن الضوء فوق البنفسجي يمكن أن يسبب تلف الحمض النووي.
5. قم بإذابة الجل في 08-1/الخطوة 2 من برنامج استخراج الجل تمامًا، وإلا ستتأثر كفاءة استعادة الحمض النووي بشكل خطير.
6. تسخين المخزن المؤقت للشطف أو ddH2O إلى 55 درجة مئوية، مما يساعد على تحسين كفاءة شطف الحمض النووي.من المستحسن تخزين الحمض النووي في شاطف 2.5 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.0 – 8.5.
