مجموعة أدوات PCR المباشرة

رقم القط: HCR2020A

تعد مجموعة Plant Direct PCR Kit مناسبة للتضخيم المباشر لأوراق النباتات والبذور وما إلى ذلك، ويمكن استخدامها لفحص عالي الإنتاجية لعينات النباتات التي لا تحتوي على السكريات والبوليفينول.يتمتع بوليميريز الحمض النووي بالتضخيم المباشر المعتمد على التطور الموجه بتحمل فائق لمثبطات PCR في النباتات.وفي الوقت نفسه، فإنه يحافظ على أداء التضخيم العالي، وهو مناسب لتضخيم أجزاء الحمض النووي في حدود 5 كيلو بايت.يمكن استخدام محلول Lysis A الفريد الموجود في المجموعة لتحلل أنسجة النباتات الطازجة أو المجمدة.إنه سهل التشغيل ويمكن استخدام المحللة كقالب للتضخيم دون تنقية.يحتوي النظام على عوامل وقائية تمكن من تضخيم العينات الخام بشكل فعال بعد التجميد والذوبان المتكرر.2 × يحتاج Plant Direct Master Mix فقط إلى إضافة الاشعال والقوالب لإجراء تفاعل التضخيم، وبالتالي تقليل عمليات سحب العينة وتحسين إنتاجية الكشف واستنساخ النتائج.

عناصر

* المخزن المؤقت للتحلل المباشر للمصنع B هو كاشف اختياري، يستخدم لتحييد المخزن المؤقت للتحلل المباشر للمصنع A لإطالة وقت تخزين العينات.ويمكن استخدامه وفقا للحالة الفعلية.

شروط التخزين

2 × Plant Direct Master Mix، يُخزن في درجة حرارة -30 ~ -15 درجة مئوية ويتجنب تكرار التجميد والذوبان؛مصنع المخزن المؤقت للتحلل المباشر، مخزن في -30 ~ -15 درجة مئوية أو 2 ~ 8 درجة مئوية.

عملية التجربة

معالجة العينات-أوراق النبات

طريقة مباشرة:يوصى باستخدام الأوراق الشابة.استخدم ثقبًا بقطر ثابت يبلغ 0.5 – 3 مم للحصول على عينة صغيرة وموحدة، ثم قم بإضافة العينة مباشرةً إلى نظام PCR (يوصى باستخدام نظام 50 ميكرولتر).ملاحظة، تأكد من أن العينة موجودة في محلول PCR وليس على جدار الأنبوب.إذا تم استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل المباشر لتضخيم الأجزاء الطويلة والعينات المعقدة، فإن استخدام عينة بقطر أصغر (0.5 - 1 مم) كقالب يمكن أن يساعد في الحصول على نتائج أفضل.

طريقة تحلل الطحن:يوصى باستخدام الأوراق الشابة.خذ قطعة صغيرة من الورقة (قطرها حوالي 1 - 3 مم)، وضعها في 20 ميكرولتر من Plant Direct Lysis Buffer Ab، وقم بطحنها قدر الإمكان (يمكن القيام بهذه الخطوة عن طريق ضغط الورقة باستخدام طرف ماصة 100 ميكرولتر لهرس العينة).إذا تم استخدام كميات أكبر من أنسجة الأوراق (لا تتجاوز 7 ملم)، زيادة حجم المخزن المؤقت للتخفيف إلى 50 ميكرولتر.بعد طحن الأوراق، يجب أن يظهر المحلول باللون الأخضر.بعد الطرد المركزي لفترة وجيزة، أضف 1 ميكرولتر من المادة الطافية إلى نظام PCR كقالب تفاعل.

طريقة التحلل الحراري:يوصى باستخدام الأوراق الشابة.خذ قطعة صغيرة من الورقة (قطرها حوالي 1 - 3 مم)، وضعها في 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل المباشر للنبات A، وقم بتسخينها عند 95 درجة مئوية لمدة 5 - 10 دقائق.يمكن تمديد وقت التحلل بشكل مناسب للأوراق التي يصعب تحللها (لا تزيد عن 20 دقيقة).إذا تم استخدام كميات أكبر من أنسجة الأوراق (لا تتجاوز 7 ملم)، زيادة حجم المخزن المؤقت للتخفيف إلى 50 ميكرولتر.بعد التسخين، قم بالطرد المركزي لفترة وجيزة، وأضف 1 ميكرولتر من المادة الطافية إلى نظام PCR كقالب تفاعل.

معالجة العينات-بذور نبات

طريقة تحلل الطحن:استخدم مشرطًا لقطع البذور التي يبلغ قطرها 5 مم، وإضافتها إلى 100 ميكرولتر من مخزن التحلل المباشر للنبات A، وطحن العينة باستخدام طرف ماصة أو أدوات أخرى.دوامة لفترة وجيزة واسمحوا الوقوف في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 – 5 دقائق.تأكد من غمر عينة البذور في المخزن المؤقت للتخفيف.بعد الطرد المركزي وجيزة، إضافة 1 ميكرولتر من طاف لنظام PCR كقالب رد الفعل.

طريقة التحلل الحراري:استخدم مشرطًا لقطع البذور التي يبلغ قطرها 5 مم، وأضفها إلى 100 ميكرولتر من محلول التحلل المباشر للنبات A، وقم بتسخينها عند 95 درجة مئوية لمدة 5 - 10 دقائق.يمكن تمديد وقت التحلل بشكل مناسب للأوراق التي يصعب تحللها (لا تزيد عن 30 دقيقة).بعد التسخين، قم بالطرد المركزي لفترة وجيزة، وأضف 1 ميكرولتر من المادة الطافية إلى نظام PCR كقالب تفاعل.

أ.يمكن أيضًا استخدام المقص أو الأدوات الأخرى لقطع عينات ذات حجم مناسب؛إذا تم إعادة استخدام المثقاب أو المقص، فيجب تنظيفهما بمحلول هيبوكلوريت الصوديوم 2٪ قبل كل استخدام لمنع التلوث المتبادل بين العينات.

ب.تأكد من ذوبان المخزن المؤقت لتحلل النبات المباشر بالكامل قبل الاستخدام.إذا كان المخزن المؤقت لزجًا أو يحتوي على رواسب، فيمكن تسخينه عند 37 درجة مئوية لإذابته تمامًا قبل الاستخدام.

ج.يمكن تعديل حجم القالب في نظام التفاعل بشكل مناسب وفقًا للاختلاف في حجم المادة النباتية والمواد المخففة المضافة.

مصنع العازلة تحلل المباشر

تم تحسين المخزن المؤقت للتحلل المباشر للنبات A الموجود في هذا المنتج بشكل صارم لتحرير جينوم معظم أنسجة النباتات وهو مناسب للتخزين قصير المدى للنباتات الخام عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.إذا كانت العينة بحاجة إلى تخزينها لفترة أطول من الوقت (على سبيل المثال، شهر إلى شهرين)، فمن المستحسن نقل المادة الطافية إلى أنبوب EP جديد وتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية.لتخزين العينات بشكل أكثر ثباتًا، قم بإضافة كمية متساوية من Plant Direct Lysis Buffer B إلى المادة الطافية المنقولة، واخلطها جيدًا وخزنها عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.يختلف وقت التخزين المستقر باختلاف عينات النباتات وحالاتها.

نظام رد الفعل

أ.أنه يحتوي على ملغ²⁺بتركيز نهائي قدره 2 ملم.

ب.يوصى باستخدام تركيز نهائي قدره 0.4 ميكرومتر لكل جهاز تمهيدي.الاستخدام المفرط للاشعال سيؤدي إلى زيادة التضخيم غير المحدد.

ج.يمكن تعديل كمية العينة المستخدمة وفقًا للوضع الفعلي.يمكن تعديل الكمية المستخدمة في تفاعل واحد من العينة الخام المتحللة بين 2% - 20% من الحجم الإجمالي للتفاعل.يمكن أن يؤدي استخدام الكثير من العينات إلى فشل التضخيم.

برنامج رد الفعل

أ.يعزز التمسخ الأولي (98 درجة مئوية، 5 دقائق) تحلل الأنسجة النباتية، ويطلق الحمض النووي الجينومي الذي يمكن استخدامه لتضخيم PCR.لا تقصر الوقت أو تخفض درجة الحرارة.

ب.يوصى بضبطها مساوية لقيمة Tm التمهيدية أو أعلى بمقدار 2 إلى 4 درجات مئوية من قيمة Tm.يختلف بوليميريز DNA التضخيم المباشر المستخدم في هذا المنتج عن بوليميريز DNA Taq التقليدي، وله متطلبات خاصة لدرجة حرارة التلدين التفاعلية؛ يمكن أن يؤدي استخدام درجة حرارة التلدين العالية إلى تقليل التضخيم غير المحدد بشكل فعال وتحسين كفاءة التضخيم.بالنسبة للقوالب المعقدة، يمكن تحقيق التضخيم الفعال عن طريق ضبط درجة حرارة التلدين وإطالة وقت التمديد.

ج.إذا كان طول منتج التضخيم ≥1 كيلو بايت، يتم ضبط وقت التمديد على 30 ثانية/كيلو بايت؛إذا كان طول منتج التضخيم > 1 كيلو بايت، يتم ضبط وقت التمديد على 60 ثانية/كيلو بايت.

د.بالنسبة للعينات المعقدة أو العينات ذات العائد المنخفض للتضخيم، يمكن زيادة عدد الدورات بشكل مناسب إلى 40 -50 دورة.

التطبيقات

ينطبق هذا على التضخيم المباشر للأنسجة النباتية والفحص عالي الإنتاجية لعينات النباتات التي لا تحتوي على السكريات والبوليفينول.

ملحوظات

للاستخدام البحثي فقط.ليس للاستخدام في إجراءات التشخيص.

1. بالنسبة لتضخيم النبات الخام أو التضخيم المباشر، يوصى باستخدام الحمض النووي الجينومي المنقى كعنصر تحكم إيجابي قبل بدء التجربة للتأكد من صحة النظام والبادئات والعمليات.

2. إن بوليميريز الحمض النووي التضخيم المباشر المستخدم في هذه المجموعة له نشاط تصحيحي قوي.إذا كان هناك حاجة إلى إجراء استنساخ TA، فمن المستحسن تنقية الحمض النووي قبل إضافة الأدينين.

3. إرشادات التصميم التمهيدي:

أ.من المستحسن أن تكون القاعدة الأخيرة عند الطرف 3′ من التمهيدي هي G أو C.

ب.يجب تجنب حالات عدم التطابق المتتالية في القواعد الثمانية الأخيرة عند الطرف 3′ من التمهيدي.ج.تجنب الهياكل دبوس الشعر في نهاية 3′ من التمهيدي.

د.يجب ألا تزيد الاختلافات في قيمة Tm للتمهيدي الأمامي والتمهيدي العكسي عن 1 درجة مئوية ويجب تعديل قيمة Tm إلى 60 ~ 72 درجة مئوية (يوصى باستخدام Primer Premier 5 لحساب قيمة Tm).

ه.لا ينبغي تضمين تسلسلات التمهيدي الإضافية الإضافية التي لا تتطابق مع القالب عند حساب قيمة التمهيدي Tm.

F.من المستحسن أن يكون محتوى GC للبرايمر 40% -60%.

ز.يجب أن يكون التوزيع الإجمالي لـ A وG وC وT في التمهيدي متساويًا قدر الإمكان.تجنب استخدام المناطق ذات المحتوى العالي من GC أو AT.

ح.تجنب وجود تسلسلات تكميلية مكونة من 5 قواعد أو أكثر سواء داخل التمهيدي أو بين اثنين من البادئات وتجنب وجود تسلسلات تكميلية من 3 قواعد أو أكثر عند الطرف 3′ من اثنين من البادئات.

أنا.استخدم الدالة NCBI BLAST للتحقق من خصوصية التمهيدي لمنع التضخيم غير المحدد.