2 × Sensi Direct Premix-UNG (مسبار qPCR)
رقم القط: HCB5151A
تم تصميم SensiDirect Premix-UNG (Probe qPCR) لإجراء PCR مباشرة من العينات دون استخراج الحمض النووي أو تحضير العينة.يتكون هذا الكاشف من بوليميريز الحمض النووي ذو البداية الساخنة، ويوراسيل جليكوزيلاز الحمض النووي (UNG)، ومثبط RNase، وMgCl2، dNTPs (مع dUTP بدلاً من dTTP)، والمثبتات، لـ PCR الكمي (qPCR).يشكل هذا الكاشف قدرة عالية على تحمل المثبط، وبالتالي يمكن تطبيقه مباشرة للكشف عن عينات مثل مسحة الحلق واللعاب والدم الكامل المضاد للتخثر والبلازما والمصل دون استخراج الحمض النووي.يستخدم الكاشف مخزنًا مؤقتًا خاصًا لـ qPCR مع إنزيمات مختلطة من بوليميريز الحمض النووي المضاد للمثبط وإنزيم UNG.ولذلك، يمكن الحصول على تضخيم جيد للجينات المستهدفة في العينات التي تحتوي على مثبطات وتمنع التضخيم الإيجابي الكاذب الناجم عن تلوث PCR المتبقي والهباء الجوي.هذا الكاشف متوافق مع معظم أدوات PCR الكمية الفلورية، مثل Applied Biosystems، وEppendorf، وBio-Rad، وRoche، وما إلى ذلك.
عناصر
1. 50 × إنزيم SensiDirect/مزيج UNG
2. 2 × SensiDirect Premix Buffer (dUTP)
شروط التخزين
ينبغي حفظ جميع المكونات عند -20 درجة مئوية للتخزين طويل الأمد و4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.يرجى الخلط جيدًا بعد الذوبان والطرد المركزي قبل الاستخدام.تجنب التجميد والذوبان المتكرر.
بروتوكول ركوب الدراجات
| خطوة | درجة حرارة | وقت | دورة |
| الهضم | 50 درجة مئوية | 2 دقيقة | 1 |
| تنشيط البوليميراز | 95 درجة مئوية | 1-5 دقيقة | 1 |
| طبيعة | 95 درجة مئوية | 10-20 ثانية | 40-50 |
| الصلب / التمديد | 56-64 درجة مئوية | 20-60 ثانية |
تعليمات الماصة
| كاشف | حجم لكل رد فعل | حجم لكل رد فعل | التركيز النهائي |
| 2×SensiDirect Premix Buffer (dUTP) | 12.5 ميكرولتر | 25 ميكرولتر | 1× |
| 50 × إنزيم سينسي دايركت/مزيج UNG | 0.5 ميكرولتر | 1 ميكرولتر | 1× |
| 25 × مزيج مسبار التمهيدي1، 2 | 1 ميكرولتر | 2 ميكرولتر | 1× |
| عينة3، 4 | - | - | - |
| ddH2O | - | - | - |
| الحجم الكلي | 25 ميكرولتر | 50 ميكرولتر | - |
1. التركيز النهائي للبرايمر عادة ما يكون 0.2μM.للحصول على نتائج أفضل، يمكن تحسين تركيز التمهيدي ضمن نطاق 0.2-1μM.
2. بشكل عام، يمكن تحسين تركيز المسبار ضمن نطاق 0.1-0.3μM.ويرتبط التركيز الأمثل للمسبار بأداة تضخيم PCR في الوقت الحقيقي، ونوع المسبار، ونوع مادة وضع العلامات الفلورية.يرجى الرجوع إلى دليل الأدوات أو المتطلبات المحددة لكل مسبار فلورسنت.
3. تحتوي الأنواع المختلفة من العينات على أنواع ومحتوى مختلف من المثبط وعدد نسخ الجين المستهدف.وينبغي النظر في حجم العينة حسب الحالة الفعلية.قم بتخفيف العينة عن طريق إضافة الماء الخالي من النيوكلياز أو المخزن المؤقت TE، إذا لزم الأمر.
4. الحجم الموصى به للعينات المختلفة:
| عينة | حجم لشخص واحد 50 ميكرولتر رد فعل | أقصى نسبة |
| الدم الكامل المضاد للتخثر | 2.5 ميكرولتر | 5% |
| بلازما | 15 ميكرولتر | 30% |
| مصل | 10 ميكرولتر | 20% |
| مسحة الحلق | 10 ميكرولتر | 20% |
| اللعاب | 10 ميكرولتر | 20% |
رقابة جودة
1. الكشف عن الوظيفة: الحساسية والنوعية والتكرار لـ qPCR.
2. لا يوجد نشاط نوكلياز خارجي: لا يوجد نوكلياز خارجي وتلوث نووي خارجي.
ملاحظات المنتج
1. يستخدم هذا المنتج نوعًا جديدًا من بوليميريز الحمض النووي ذو البداية الساخنة، والذي يمكن تنشيطه خلال 1-5 دقائق. نظرًا لتحسين المخزن المؤقت للتفاعل الخاص به، فهو أكثر ملاءمة لـ PCR الكمي المزدوج أو المتعدد باستخدام طريقة المسبار.
2. إذا كانت قيمة Rn لتضخيم PCR منخفضة جدًا أو تم منع التضخيم بشكل واضح، فقد يؤدي تقليل كمية العينة أو زيادة حجم التفاعل أو التخفيف السابق للعينة إلى تحسين النتائج.
3. يجب أن يتبع جمع الدم واللعاب والبول ومسحة الحلق وما إلى ذلك متطلبات المعايير السريرية، ويمكن استخدام عينة جديدة لمنع تحلل الحمض النووي.
4. منذ amplicons مختلفة لها كفاءة استخدام مختلفة لdUTP وحساسية للأمم المتحدة، ينبغي تحسين الكواشف إذا انخفضت حساسية الكشف عند استخدام نظام UNG.يرجى الاتصال بنا للحصول على الدعم الفني إذا لزم الأمر.
5. لتجنب تضخيم منتجات PCR المرحل بين ردود الفعل خطوة واحدة، مطلوبة منطقة تجريبية مخصصة وماصة للتضخيم.استخدم القفازات وقم بالتغيير بشكل متكرر ولا تفتح أنبوب التفاعل بعد تضخيم PCR.
