بروتيناز K mNGS (سائل)
بروتيناز K هو بروتياز سيرين مستقر ذو خصوصية واسعة للركيزة.إنه يتحلل العديد من البروتينات في حالته الأصلية حتى في وجود المنظفات.تشير الأدلة المستمدة من دراسات التركيب البلوري والجزيئي إلى أن الإنزيم ينتمي إلى عائلة سبتيليسين مع ثالوث محفز نشط في الموقع (Asp39-له69-سر224).الموقع السائد للانقسام هو الرابطة الببتيدية المجاورة لمجموعة الكربوكسيل من الأحماض الأمينية الأليفاتية والعطرية مع مجموعات ألفا أمينية محجوبة.يتم استخدامه عادة لخصوصيته الواسعة.تم تصميم هذا البروتيناز K خصيصًا لـ mNGS.بالمقارنة مع بروتيناز K الآخر، فهو يحتوي على تلوث أقل بالحمض النووي مع نفس الأداء الأنزيمي، والذي يمكن أن يضمن تطبيق mNGS بشكل أفضل.
شروط التخزين
2-8 درجة مئوية لمدة عامين
تخصيص
| مظهر | عديم اللون إلى السائل البني الفاتح |
| نشاط | ≥800 وحدة / مل |
| تركيز البروتين | ≥20 ملغم/مل |
| نيكاسي | أيا الكشف |
| الدناز | أيا الكشف |
| رناسي | أيا الكشف |
ملكيات
| رقم المفوضية الأوروبية | 3.4.21.64(مؤتلف من ألبوم Tritirachium) |
| نقطة تساوي الكهربية | 7.81 |
| الرقم الهيدروجيني الأمثل | 7.0- 12.0 الشكل 1 |
| درجة الحرارة المثلى | 65 درجة مئوية الشكل 2 |
| استقرار الرقم الهيدروجيني | درجة الحموضة 4.5- 12.5 (25 درجة مئوية، 16 ساعة) شكل 3 |
| الاستقرار الحراري | أقل من 50 درجة مئوية (درجة الحموضة 8.0، 30 دقيقة) الشكل 4 |
| استقرار التخزين | أكثر من 90% من النشاط لمدة 12 شهرًا عند درجة حرارة 25 درجة مئوية |
| المنشطات | الحزب الديمقراطي الصربي، واليوريا |
| مثبطات | ثنائي إيزوبروبيل فلوروفوسفات؛فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل |
التطبيقات
1. مجموعة التشخيص الجيني
2. مجموعات استخراج الحمض النووي الريبي (RNA) والحمض النووي (DNA).
3. استخلاص المكونات غير البروتينية من الأنسجة، وتحلل شوائب البروتين، مثل الحمض النووياللقاحات وتحضير الهيبارين
4. تحضير الحمض النووي الكروموسومي عن طريق الفصل الكهربائي النبضي
5. لطخة غربية
6. كواشف الألبومين الإنزيمية الغليكوزيلية في التشخيص المختبري
احتياطات
قم بارتداء القفازات والنظارات الواقية عند الاستخدام أو الوزن، وحافظ على التهوية الجيدة بعد الاستخدام.قد يسبب هذا المنتج رد فعل تحسسي للجلد وتهيجًا خطيرًا للعين.وفي حالة استنشاقه قد يسبب أعراض الحساسية أو الربو أو ضيق التنفس.قد يسبب تهيج الجهاز التنفسي.
تعريف الوحدة
يتم تعريف الوحدة الواحدة (U) على أنها كمية الإنزيم المطلوبة لتحلل الكازين لإنتاج 1 ميكرومولالتيروزين في الدقيقة في ظل الظروف التالية.
تحضير الكواشف
الكاشف الأول: تم إذابة 1 جم من كازين الحليب في 50 مل من محلول فوسفات الصوديوم 0.1 م (درجة الحموضة 8.0)، وحضنت في ماء بدرجة حرارة 65-70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، وتم التقليب والذوبان، ثم تبريدها بالماء، وضبطها بواسطة هيدروكسيد الصوديوم إلى درجة الحموضة 8.0، وحجم ثابت. 100 مل.
الكاشف الثاني: 0.1 م حمض ثلاثي كلورو أسيتيك، 0.2 م خلات الصوديوم، 0.3 م حمض أسيتيك.
الكاشف الثالث: 0.4M نا2CO3حل.
الكاشف الرابع: كاشف الفورينت المخفف بالماء النقي لمدة 5 مرات.
الكاشف الخامس: مخفف الإنزيم: 0.1 م محلول فوسفات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 8.0).
الكاشف السادس: محلول التيروزين: 0، 0.005، 0.025، 0.05، 0.075، 0.1، 0.25 أومول/مل تيروزين مذاب بـ 0.2م حمض الهيدروكلوريك.
إجراء
1. تم تسخين 0.5 مل من الكاشف I مسبقًا إلى 37 درجة مئوية، وإضافة 0.5 مل من محلول الإنزيم، وخلطه جيدًا، واحتضانه في درجة حرارة 37 درجة مئوية.37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
2. أضف 1 مل من الكاشف II لإيقاف التفاعل، واخلط جيدًا، واستمر في الحضانة لمدة 30 دقيقة.
3. حل رد الفعل بالطرد المركزي.
4. خذ 0.5 مل من المادة الطافية، وأضف 2.5 مل من الكاشف III، و0.5 مل من الكاشف IV، واخلط جيدًا واحتضن عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.لمدة 30 دقيقة.
5. التطوير التنظيمي660تم تحديده على أنه OD1;مجموعة التحكم الفارغة: يتم استخدام 0.5 مل من الكاشف V ليحل محل الإنزيمحل لتحديد OD660كما التطوير التنظيمي2، ΔOD=OD1-OD2.
6. منحنى L-tyrosine القياسي: 0.5 مل محلول L-tyrosine بتركيز مختلف، 2.5 مل كاشف III، 0.5 مل كاشف IV في أنبوب طرد مركزي 5 مل، احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، كشف عن OD660لتركيزات مختلفة من L-tyrosine، ثم الحصول على المنحنى القياسي Y=kX+b، حيث Y هو تركيز L-tyrosine، X هو OD600.
عملية حسابية
2: الحجم الإجمالي لمحلول التفاعل (مل)
0.5: حجم محلول الإنزيم (مل)
0.5: حجم سائل التفاعل المستخدم في تحديد اللونية (مل)
10: وقت رد الفعل (دقيقة)
Df: التخفيف المتعدد
C: تركيز الإنزيم (ملجم/مل)
مراجع
1. ويجر يو وهيلز إتش. فيبس ليت.(1972);23:77.
2. ويجر يو وهيلز هـ. الكيمياء الحيوية.بيوفيس.الدقة.مشترك.(1971);44:513.
3. هيلز، ه.وآخرون.،يورو.جي. الكيمياء الحيوية.(1975);56:103-108.
4. سامبروك جet آل، الاستنساخ الجزيئي: دليل المختبر، الطبعة الثانية، كولد سبرينج هاربورمطبعة المختبر، كولد سبرينج هاربور (1989).
الأرقام
تين.1 الأمثل pH
محلول عازل 100 مم: pH6.0-8.0، فوسفات الصوديوم؛pH8.0-9.0، تريس-حمض الهيدروكلوريك؛درجة الحموضة 9.0-12.5، جليكاين-هيدروكسيد الصوديوم.تركيز الإنزيم: 1 ملغ/مل
الشكل 2: درجة الحرارة المثلى
رد الفعل في 20 ملم K- الفوسفات العازلة درجة الحموضة 8.0.تركيز الانزيم: 1 ملغم/مل
الشكل 3 الرقم الهيدروجيني استقرار
25 درجة مئوية، 16 ساعة معالجة بمحلول عازل 50 مم: درجة الحموضة 4.5-5.5، أسيتات؛الرقم الهيدروجيني 6.0-8.0، فوسفات الصوديوم؛الرقم الهيدروجيني 8.0-9.0، تريس-حمض الهيدروكلوريك.درجة الحموضة 9.0- 12.5، جليكاين هيدروكسيد الصوديوم.تركيز الانزيم: 1 ملغم/مل
الشكل 4 الحراري استقرار
30 دقيقة من العلاج مع 50 ملي مولار Tris-HCl، درجة الحموضة 8.0.تركيز الانزيم: 1 ملغم/مل
الشكل 5 التخزين استقرارty at 25 درجة مئوية
