بروتيناز ك (سائل)
رقم القط: HC4502A
بروتيناز K هو بروتياز سيرين مستقر ذو خصوصية واسعة للركيزة.إنه يتحلل العديد من البروتينات في حالته الأصلية حتى في وجود المنظفات.تشير الأدلة المستمدة من دراسات التركيب البلوري والجزيئي إلى أن الإنزيم ينتمي إلى عائلة سبتيليسين مع ثالوث محفز نشط في الموقع (Asp39-له69- سر224).الموقع السائد للانقسام هو الرابطة الببتيدية المجاورة لمجموعة الكربوكسيل من الأحماض الأمينية الأليفاتية والعطرية مع مجموعات ألفا أمينية محجوبة.ويستخدم عادة لنطاقه الواسعالنوعية.
تخصيص
| مظهر | عديم اللون إلى السائل البني الفاتح |
| نشاط | ≥800 وحدة / مل |
| تركيز البروتين | ≥20 ملغم/مل |
| الدناز | أيا الكشف |
| رناسي | أيا الكشف |
شروط التخزين
يخزن في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية.
ملكيات
| رقم المفوضية الأوروبية | 3.4.21.64 (رمؤتلف من ألبوم Tritirachium) |
| الوزن الجزيئي الغرامي | 29 كيلو دالتون (SDS-PAGE) |
| نقطة تساوي الكهربية | 7.81 |
| الرقم الهيدروجيني الأمثل | 7.0-12.0 الشكل 1 |
| درجة الحرارة المثلى | 65 درجة مئوية الشكل 2 |
| استقرار الرقم الهيدروجيني | الرقم الهيدروجيني 4.5-12.5 (25 درجة مئوية، 16 ساعة) الشكل 3 |
| الاستقرار الحراري | أقل من 50 درجة مئوية (درجة الحموضة 8.0، 30 دقيقة) الشكل 4 |
| المنشطات | الحزب الديمقراطي الصربي، واليوريا |
| مثبطات | ثنائي إيزوبروبيل فلوروفوسفات؛فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل |
التطبيقات
1. مجموعة التشخيص الجيني
2. مجموعات استخراج الحمض النووي الريبي (RNA) والحمض النووي (DNA).
3. استخلاص المكونات غير البروتينية من الأنسجة وتحلل شوائب البروتين مثل لقاحات الحمض النووي وتحضير الهيبارين
4. تحضير الحمض النووي الكروموسومي عن طريق الفصل الكهربائي النبضي
5. لطخة غربية
6. كواشف الألبومين الإنزيمية الغليكوزيلية في التشخيص المختبري
احتياطات
قم بارتداء القفازات والنظارات الواقية عند الاستخدام أو الوزن، وحافظ على التهوية الجيدة بعد الاستخدام.قد يسبب هذا المنتج رد فعل تحسسي للجلد وتهيجًا خطيرًا للعين.وفي حالة استنشاقه قد يسبب أعراض الحساسية أو الربو أو ضيق التنفس.قد يسبب تهيج الجهاز التنفسي.
فحص
تعريف الوحدة
يتم تعريف وحدة واحدة (U) على أنها كمية الإنزيم المطلوبة لتحلل الكازين لإنتاج 1 ميكرومول من التيروزين في الدقيقة في ظل الظروف التالية.
تحضير الكواشف
الكاشف الأول: تم إذابة 1 جم من كازين الحليب في 50 مل من محلول فوسفات الصوديوم 0.1 م (الرقم الهيدروجيني 8.0)، وتم تحضينه في ماء درجة حرارته 65-70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، وتحريكه وإذابته، وتبريده بالماء، وتعديله بواسطة هيدروكسيد الصوديوم إلى الرقم الهيدروجيني 8.0، وتثبيته. حجم 100 مل.
الكاشف الثاني: محلول TCA: حمض ثلاثي كلورو أسيتيك 0.1 م، أسيتات الصوديوم 0.2 م، حمض أسيتيك 0.3 م.
الكاشف الثالث: 0.4M نا2CO3حل.
الكاشف الرابع: كاشف الفورينت المخفف بالماء النقي لمدة 5 مرات.
الكاشف الخامس: مخفف الإنزيم: 0.1 م محلول فوسفات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 8.0).
الكاشف السادس: محلول التيروزين:0، 0.005، 0.025، 0.05، 0.075، 0.1، 0.25 أومول/مل تيروزين مذاب مع 0.2M حمض الهيدروكلوريك.
إجراء
1. يتم تسخين 0.5 مل من الكاشف I مسبقًا إلى 37 درجة مئوية، وإضافة 0.5 مل من محلول الإنزيم، وتخلط جيدًا، وتحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
2. أضف 1 مل من الكاشف II لإيقاف التفاعل، واخلط جيدًا، واستمر في الحضانة لمدة 30 دقيقة.
3. حل رد الفعل بالطرد المركزي.
4. خذ 0.5 مل من المادة الطافية، وأضف 2.5 مل من الكاشف III، و0.5 مل من الكاشف IV، واخلط جيدًا واحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
5. التطوير التنظيمي660تم تحديده على أنه OD1;مجموعة التحكم الفارغة: يستخدم الكاشف V 0.5 مل ليحل محل محلول الإنزيم لتحديد OD660كما التطوير التنظيمي2، ΔOD=OD1-OD2.
6. منحنى L-tyrosine القياسي: 0.5 مل محلول L-tyrosine بتركيز مختلف، 2.5 مل كاشف III، 0.5 مل كاشف IV في أنبوب طرد مركزي 5 مل، احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، كشف عن OD660لتركيزات مختلفة من L-tyrosine، ثم الحصول على المنحنى القياسي Y=kX+b، حيث Y هو تركيز L-tyrosine، X هو OD600.
عملية حسابية
2: الحجم الإجمالي لمحلول التفاعل (مل)
0.5: حجم محلول الإنزيم (مل)
0.5: حجم سائل التفاعل المستخدم في تحديد اللونية (مل)
10: وقت رد الفعل (دقيقة)
Df: التخفيف المتعدد
C: تركيز الإنزيم (ملجم/مل)
مراجع
1. ويجر يو وهيلز إتش. فيبس ليت.(1972);23:77.
2. ويجر يو وهيلز هـ. الكيمياء الحيوية.بيوفيس.الدقة.مشترك.(1971);44:513.
3. هيلز، ه.وآخرون.،يورو.جي. الكيمياء الحيوية.(1975);56:103-108.
4. سامبروك جet آل، الاستنساخ الجزيئي: دليل مختبري، الطبعة الثانية، مطبعة مختبر كولد سبرينج هاربور، كولد سبرينج هاربور (1989).
الأرقام
تين. 1 الأمثل pH
محلول عازل 100 ملم: pH6.0-8.0، فوسفات الصوديوم؛درجة الحموضة 8.0- 9.0، تريس-حمض الهيدروكلوريك؛درجة الحموضة 9.0-12.5، جليكاين-هيدروكسيد الصوديوم.تركيز الإنزيم: 1 ملغ/مل
الشكل 2: درجة الحرارة المثلى
رد الفعل في 20 ملم K- الفوسفات العازلة درجة الحموضة 8.0.تركيز الانزيم: 1 ملغم/مل
الشكل 3 الرقم الهيدروجيني استقرار
25 درجة مئوية، 16 ساعة معالجة بمحلول منظم 50 مم: درجة الحموضة 4.5-5.5، أسيتات؛الرقم الهيدروجيني 6.0-8.0، فوسفات الصوديوم؛الرقم الهيدروجيني 8.0-9.0، تريس-حمض الهيدروكلوريك.درجة الحموضة 9.0-12.5، جليكاين هيدروكسيد الصوديوم.تركيز الانزيم: 1 ملغم/مل
الشكل 4: حراري استقرار
معالجة لمدة 30 دقيقة باستخدام 50 ملي مولار من محلول Tris-HCl، درجة الحموضة 8.0.تركيز الانزيم: 1 ملغم/مل
الشكل 5: التخزين استقرارty at 25 درجة مئوية
